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遗传性视网膜变性是一类重要的神经退行性疾病,也是当今世界上导致人类遗传性失明的主要原因。根据临床症状的不同,遗传性视网膜变性主要可分为:黄斑变性(Macular degeneration,MD)、视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)、视锥-视杆细胞营养不良(Cone-rod dystrophy,CRD)等,这类疾病的共同特点就是视网膜的结构或功能发生紊乱并逐渐导致感光细胞死亡。目前,大约已有200个视网膜变性致病基因已被鉴定,但是对于这些基因突变导致视网膜变性的具体分子机制研究还是不够全面与深入。2008年Abd El-Aziz等人首次发现了EYS(Eyes shut homolog)基因,并在常染色体隐性视网膜色素变性患者中发现了EYS基因的6种不同突变。随后,Katagiri等人又发现EYS基因突变之后不只会导致RP也会导致CRD。根据目前已有文献的报道,在RP和CRD病人中共发现的EYS基因突变大约有100种。虽然大量的EYS基因突变已被发现,但对于EYS基因在视网膜中的具体分子功能以及该基因突变是如何导致视网膜变性疾病发生的分子机制仍然不清楚。人类EYS基因全长约2Mb,共包含46个外显子,编码一个含3165个氨基酸的蛋白,是目前最大的视网膜变性致病基因之一。人类EYS基因与果蝇Eyes shut基因同源,并在斑马鱼、鸡、恒河猴等物种都有同源基因,但是在小鼠、大鼠等物种没有发现其同源基因。之前对EYS蛋白的一些功能研究主要是利用果蝇为模式生物来进行的,但由于果蝇的感光细胞结构与人类相比存在较大差异,所以对EYS突变的具体致病机制目前还不清楚。由于斑马鱼的视网膜结构与人类更为相似,所以本文将利用斑马鱼为动物模型来研究与探讨EYS基因的具体功能。本文采用TALEN技术构建了eys基因敲除型斑马鱼品系,并应用此基因敲除型斑马鱼作为研究对象来进行后续相关分子病理机制的研究与探讨。视网膜电图的检测结果显示,在受精后的第10天eys基因敲除型斑马鱼的b波振幅与WT斑马鱼相比下调了约28%,表明eys基因敲除后对斑马鱼的早期视觉功能造成了一定程度的损伤;通过qRT-PCR和Western Blot方法检测光转导级联反应中相关基因和蛋白表达水平的变化,发现在eys基因敲除型斑马鱼中光转导反应受到了一定程度的影响;对视网膜组织切片进行苏木素-伊红染色后,可以看到eys基因敲除型斑马鱼的外核层厚度随着其年龄的增长而逐渐变薄,经数据统计,我们发现eys基因敲除型斑马鱼的外核层厚度从第3个月起开始显著下降,到了16个月时其外核层厚度只占WT斑马鱼的37.4%;TUNEL染色结果显示,8个月时在eys基因敲除型斑马鱼的视网膜中发生凋亡的感光细胞数量明显多于WT斑马鱼,并且随着斑马鱼的年龄增长发生凋亡的细胞数量逐渐增多;应用免疫荧光标记方法对五种不同类型的感光细胞外节视蛋白进行观察分析,结果显示这五种感光细胞均发生了不同程度的退化现象,通过综合分析与比较,发现UV视锥细胞开始退化的时间最早,相对视杆细胞而言,视锥细胞退化的程度总体上较为迅速,而这一特点与临床上对CRD症状的描述更为接近;我们还发现在eys基因敲除型斑马鱼的视网膜中,一些外节相关蛋白(Rhodopsin,Opn1lw,Opn1sw1,Gnb3,Prph2)发生了错误定位,其中红视锥细胞和UV视锥细胞的视蛋白在10天时就已经出现轻微的错误定位,该结果表明外节蛋白错误定位可能与感光细胞死亡有重要关系;对感光细胞中细胞骨架蛋白F-actin的形态结构观察结果显示,在eys基因敲除型斑马鱼中F-actin的形态结构发生了紊乱,并且视网膜组织中的F/G-actin的比例出现了下调,该结果表明感光细胞的CP结构受到了影响。综上所述,我们通过采用TALEN技术构建了一个eys基因敲除型斑马鱼品系;对视网膜组织切片的病理组织学观察和功能研究表明在斑马鱼中eys基因缺失引起的视网膜变性更接近于视锥-视杆细胞营养不良的症状;eys基因缺失还影响了斑马鱼感光细胞中一些外节蛋白的正常定位,同时破坏了感光细胞中细胞骨架F-actin的正常形态结构。这些发现提示Eys蛋白对感光细胞外节蛋白的正确运输和定位具有一定的影响作用,同时还对细胞骨架蛋白F-actin的形态结构具有维持作用,而这些功能一旦受损便可能引起感光细胞中发生随后的一系列损伤并最终导致视网膜感光细胞变性。