论文部分内容阅读
背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是临床上最常见的神经退行性疾病之一,临床上主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍等。大多数PD患者为散发性,但少数是由基因突变引起的遗传性帕金森病。随着遗传学研究方法的不断进步,尤其是高通量测序技术的发展,近年来遗传性帕金森病新的致病基因被不断发现,而针对这些PD致病基因开展的系列功能研究对认识PD的发病机制有着重要意义。但仍有部分遗传性帕金森病家系致病基因不明确。目的:在前期工作中,我们收集到一个中国汉族帕金森综合征家系,本研究拟在前期工作基础上,通过外显子组测序技术,探寻此帕金森综合征家系的致病基因,利用PET-CT观察此家系影像学特点。同时,分析其致病基因多态性与散发性PD的相关性。并在细胞模型及动物模型上进一步探讨此基因突变致病的可能机制。方法:1详细记录本研究家系内所有成员的临床资料,对本家系内2例患者进行全外显子组测序,结合生物信息分析,寻找候选致病基因位点。并进行Sanger测序验证,同时在相关病人及正常对照中进行验证。2对家系内2例患者及1例正常对照进行[11C］CFT标记的脑多巴胺转运体PET-CT显像及18F-FDG标记的脑葡萄糖代谢PET-CT显像。3 纳入364名散发性PD患者和384名正常对照,对CHCHD2基因进行Sanger测序,探讨CHCHD2基因多态性与中国汉族人群散发性PD相关性。4 构建CHCHD2野生型及突变型真核表达载体,及稳定过表达野生型及突变型CHCHD2和稳定抑制CHCHD2表达单克隆SHSY5Y细胞系。研究CHCHD2蛋白在细胞应激条件下的表达情况,及T61I突变后蛋白稳定性、亚细胞定位变化。5 运用已构建的CHCHD2野生型及突变型过表达和表达抑制单克隆细胞系,研究突变后细胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白表达水平、膜电位、活性氧、ATP及细胞有氧呼吸水平变化。分离并培养突变携带患者来源的皮肤成纤维细胞,研究CHCHD2及相关蛋白表达水平变化。6 检测CHCHD2突变后磷酸化水平的改变。探讨CHCHD2蛋白和RBPJ、COX1、CHCHD10及MICS1蛋白相互作用。检测突变携带患者来源的皮肤成纤维细胞中CHCHD10相关蛋白表达水平,及线粒体形态改变。7利用家系内CHCHD2T61I突变携带患者的外周血单个核细胞,诱导iPS细胞系并鉴定。利用小鼠胚胎干细胞打靶技术,构建CHCHD2T61I点突变小鼠模型。结果:1本研究纳入的帕金森综合征家系符合常染色体显性遗传规律。除帕金森症状外,先证者有重叠多系统萎缩的临床特征,另一名家庭成员则表现为特发性震颤。应用全外显子组捕获及高通量测序,结合后续生物信息学分析,我们发现CHCHD2基因的c.182C>T(p.T61I)突变是本家系的致病位点。2 此家系内携带CHCHD2 c.182C>T(p.T61I)突变患者的PET-CT结果显示,多巴胺转运体显像信号明显减低,与临床严重情况呈负相关,与散发性PD患者结果类似。而其壳核和苍白球葡萄糖代谢水平明显增高,这也符合18F-FDG PET-CT的PD相关模式特点。3 在汉族散发性PD患者中,我们发现了 5个已知的多态位点:c.-11G>A、c.-11G>A、c.5C＞T、c.51-127G>A、c.456+125G>A。经统计分析后,位点c.5C>T的差异有统计学意义(OR= 4.79,95%CI= 1.03-22.26,p = 0.03),其余四个位点在两组间的差异均无统计学意义。4成功构建CHCHD2野生型及突变型真核表达载体,及筛选出CHCHD2稳定过表达和稳定抑制的单克隆细胞系。CHCHD2蛋白在细胞应激条件下的高表达,T61I突变后蛋白稳定性、亚细胞定位无明显变化。5与对照相比,CHCHD2表达抑制的单克隆细胞系在细胞活力、凋亡水平、凋亡蛋白、膜电位、活性氧、ATP及细胞有氧呼吸水平均受到影响。而在稳转过表达细胞系中,和野生型蛋白相比,在应激条件下,T61I突变后CHCHD2蛋白对细胞的保护作用丧失。在患者来源的皮肤成纤维细胞中,CHCHD2蛋白及mRNA水平均不改变。6 CHCHD2突变后磷酸化水平未改变。CHCHD2蛋白与CHCHD10蛋白存在相互作用,且CHCHD2突变后与CHCHD10结合水平更高。患者来源的皮肤成纤维细胞中CHCHD10及DRP1蛋白水平降低,CHCHD2与MICS1结合水平降低。CHCHD2突变患者皮肤成纤维细胞线粒体形态严重受损。7 构建了患者来源疾病特异性CHCHD2突变型iPS细胞系,相关指标鉴定正确。构建了 CHCHD2T61I点突变小鼠模型,鉴定正确。结论:1.CHCHD2基因的c.182C>T(p.T611)突变是本研究纳入的帕金森综合征家系的致病位点,即CHCHD2突变可导致常染色体显性帕金森综合征。2.在散发性PD患者中,CHCHD2多态位点c.5C>T与正常对照相比,差异有统计学意义,表明携带c.5C>T可能增加患PD的风险。3.野生型CHCHD2蛋白对细胞具有保护作用,而T61I突变型CHCHD2蛋白并无细胞毒性,但是丧失了对细胞的保护功能。4.CHCHD2和CHCHD1O的相互作用可能在发病过程中起重要作用。5.成功构建了患者来源的疾病特异性CHCHD2突变型iPS细胞系及CHCHD2 T61I点突变小鼠模型。