猴头菇多糖的结构表征、免疫调节活性及其机理研究

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猴头菇(Hericium erinaceus),又名猴头菌、猴头、猴头蘑、对脸蘑,在日本又被称为山伏茸,属于担子菌亚门、担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属。猴头菇富含多种生物活性成分,如猴头菇酮、猴头素、糖蛋白、多糖、生物碱等。作为其中最主要的活性成分,猴头菇多糖具有抗氧化、抗慢性胃炎等生物活性。但是目前对其体内体外免疫活性及机理的研究较少。本课题以猴头菇子实体为原料,对猴头菇多糖的主要组分HEP-W进行了分离纯化、结构鉴定、链构象表征及体内体外免疫活性方面的研究,并以巨噬细胞为靶细胞,深入探讨了HEP-W免疫调节活性的分子机制。主要研究结果如下:(1)通过水提醇沉、Sevage法去蛋白后得到了猴头菇粗多糖,得率为(2.56±0.14)%(w/w)。经过DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对粗多糖进一步分离纯化,得到HEP-W组分。化学结构分析表明猴头菇纯化后的HEP-W多糖组分的平均相对分子量为1.59×10~4 Da;主要是由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔比为0.98:1.59:0.89:5.60:7.06。综合红外光谱、高碘酸氧化、Smith降解及核磁共振分析,HEP-W的单糖残基类型主要为:(1→)-α-D-葡萄糖,(1→3,6)-α-D-葡萄糖,(1→2,6)-α-D-半乳糖,T-β-半乳糖,(1→3,4)-β-D-甘露糖,(1→3)-α-鼠李糖以及(1→2)-β-L-岩藻糖。热重分析表明HEP-W具有较好的热稳定性,玻璃化转变温度为77.2℃,热分解温度为348.5℃。(2)原子力显微镜显示在溶液中的HEP-W以柔顺性链构象存在,多糖单链的高度约为0.12~1.5 nm,直径约在250~615 nm;X射线衍射与刚果红试验分别表明HEP-W为无定型结构,并且无三螺旋的空间构象;粘度测定结果表明猴头菇多糖溶液表现出典型的假塑性流体行为,且粘度随着质量浓度的增大而升高。(3)内毒素测定结果表明本试验中分离纯化得到的猴头菇多糖HEP-W并无内毒素污染。体外细胞实验表明HEP-W能有效促进正常小鼠T、B淋巴细胞的增殖,同时,ELISA法测定结果表明:与空白对照组相比,HEP-W能显著促进淋巴细胞IL-2、IL-4以及IFN-γ的分泌(p<0.05),并呈现明显的剂量效应相关性。(4)选用小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为细胞模型,进行了HEP-W的体外免疫实验。结果显示,在100~1000μg/mL的浓度范围内能显著增强RAW 264.7细胞的吞噬活性,并能显著促进NO、IL-6、TNF-α的分泌,同时iNOS、IL-6与TNF-αmRNA的表达量也显著增加(p<0.05)。(5)Toll样受体2(TLR 2)和甘露糖受体(MR)是RAW 264.7巨噬细胞识别猴头菇纯化多糖HEP-W的主要受体,并通过MyD88/IRAK-1/TRAF-6/PI3K/Akt/MAPKs信号转导通路激活巨噬细胞。(6)动物实验表明,HEP-W对环磷酰胺所致小鼠的免疫抑制作用有明显的改善作用:HEP-W能够显著提高免疫低下小鼠的外周血白细胞数、骨髓有核细胞数,促进ConA和LPS诱导的T、B脾淋巴细胞增殖,提高脾脏NK细胞的杀伤活性,并能提高血清中细胞因子IL-2的分泌水平(p<0.05);此外,HEP-W能显著提高免疫抑制小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的活性,降低丙二醛的含量。
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