伴随着血管生成而形成的肿瘤血液供应是实体瘤发生发展的关键步骤。普遍认为只有内皮细胞可以形成血管,但当内皮依赖的血管生成不能满足肿瘤的快速增殖时,一种重要的替代供血方式出现,即由肿瘤来源的非内皮细胞形成血管样网络—血管生成拟态(Vasculogenic mimicry, VM)。VM是部分肿瘤增殖早期获得供氧的主要途径,对肿瘤的生长和转移具有重要作用。目前仅有一项临床研究表明抗血管内皮生长因子受体2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)拮抗剂改善胃癌(Gastric cancer, GC)患者预后,但其他多项研究均表明针对血管内皮的抗血管生成治疗药物(Bevacizuma环能完全解决肿瘤的治疗问题。应用抗VEGF治疗后,反而促进卵巢癌患者VM形成,提示当内皮依赖的血管生成被抑制时,VM可以作为一种重要的替代供血模式。大量临床与实验研究表明,黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胶质瘤等多种肿瘤中均存在VM;临床病理资料研究显示有VM的病人预后比无VM的病人预后差。但仅有少量研究探讨了VM在GC中的作用,VM主要出现在分化程度差的GC中,抑癌基因可以抑制VM形成,癌基因可促进肿瘤VM形成,因此,靶向促VM形成的癌基因,可有效抑制肿瘤的发生发展。结肠癌转移相关基因一1(Metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)是HGF/c-Met(Hepatocyte growth factor/Met tyrosine kinase receptor)信号通路活化的重要调节因子。我们前期研究表明MACC1高表达预示GC患者较差的临床预后,同时,我们发现MACC1通过HGF/c-Met信号通路促进GC细胞增殖,并通过上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)促进GC细胞侵袭和迁移。既往研究表明EMT可促进肿瘤进展,参与VM进程。HGF诱导MACC1核转位发挥生物学功能。因此我们假设 MACC1可能在GC的VM形成中发挥重要作用。已知EMT调控蛋白主要包括TWIST1和TWIST2。TWIST1可诱导EMT的发生,同时促进肝细胞癌的VM形成。TWIST2作为bHLH(basic helix-loop-helix)转录家族成员,与TWIST1具有90%序列同源性。TWIST2参与多种肿瘤的EMT发生,提示TWIST2也可能在VM形成中发挥重要作用,但关于TWIST2是否参与VM形成尚不清楚。我们假设MACC1通过核转位活化TWIST1/2信号通路促进GC的VM进程。VE-cadherin是最早发现的VM形成相关蛋白,其属于内皮细胞的黏附分子,具有激酶活性。有研究报道,沉默VE-cadherin可明显抑制VM条索样结构。E-cadherin是上皮细胞重要表型之一,其表达缺失被认为是EMT发生的重要标志。我们前期研究证实了MACC1下调E-cadherin表达。Sun等研究也证实TWIST1通过上调VE-cadherin表达,下调E-cadherin促进肝癌VM发生。说明"TWIST1/2-VE-cadherin"可能参与MACC1诱导的VM进程。已知,VEGFR2(又称Flk1/KDR)是VEGF促有丝分裂、促血管生成的主要调节因子,参与VM形成。TWIST1上调VE-cadherin和VEGFR2表达,促进肝癌VM发生。以上提示MACC1可能通过EMT相关信号通路,即"TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"促进肿瘤细胞表达内皮细胞相关标志物,最终形成VM。在本研究中,我们首次探讨MACC1是否与GC的VM形成相关,利用88例GC患者临床病理资料,分析MACC1与VM共表达对GC患者预后的影响。同时,我们利用GC动物模型和GC细胞株,验证MACC1在VM形成中的作用,证明" HGF/c-Met-MACC 1-TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"信号通路是MACC1促进GC VM形成的具体机制。第一部分胃癌中存在VM,其与MACC1共表达预示胃癌患者不良预后[目的]观察VM是否存在及其与临床预后的关系；探讨MACC1表达与VM之间的关系,及二者同时表达对临床预后的影响。[方法]收集88例由南方医科大学南方医院2005.1-2010.12间经姑息性手术切除,且随访资料齐全并经病理诊断为胃癌(Ⅳ期)的手术标本,并对临床病例资料和随访资料进行整理分析(随访患者总生存时间：是指接受手术治疗日起至任何原因死亡之间的时间,截至分析之日尚存活或未发生病情进展的患者将以他们最后一次取得联系的日期作为截止时间)；利用HE染色和CD31/PAS双染法观察88例GC组织中是否存在VM,并计数PAS/VM密度；利用透射电镜观察VM的超微结构：以免疫组织化学方法检测VM不同密度组中MACC1蛋白表达,分析二者之间的相关性及其与临床预后的关系,进行统计学分析。[结果]1)在88例GC标本中,发现38例(38/88,43.0%)GC标本具有典型VM结构；2)VM密度与肿瘤分化程度、转移灶数目及GC患者生存状态正相关；生存分析表明VM高密度组的GC患者生存时间更短；3)生存分析提示MACC1高表达,GC患者预后差；进一步结果提示,在MACC1与VM共阳性表达组的GC患者中,3年生存率仅为8.6%；而MACC1与VM共阴性表达组的GC患者,3年生存率为41.7%；4)单因素及多因素分析表明VM是GC患者重要的预后因子。[小结]1)VM主要存在于分化差、恶性程度高的低分化型GC中,提示VM与GC的恶性生物学行为相关；2)VM结构与Ⅳ期GC患者远处器官转移灶数目相关,提示VM与GC进展相关：3)VM密度与MACC1表达正相关,推测癌基因可能促进VM形成。第二部分MACC1上调TWIST1/2表达促进胃癌VM形成[目的]利用GC细胞系观察MACC1对VM形成能力的影响,利用GC动物模型进一步证明MACC1表达与VM形成的关系,分析其对TWIST1/2的调控作用。从分子层面研究VM形成的机制。[方法]我们前期已通过筛选GC细胞系,构建MACC1表达质粒(oxMACC1)和MACC1干扰质粒(shMACC1)。本部分研究通过购买TWIST1和TWIST2 siRNA质粒,转染GC细胞,获得TWIST1和TWIST2下调模型,qRT-PCR和Western blot鉴定转染效果；利用GC动物皮下瘤和转移瘤模型,分析MACC1不同表达组中VM密度及TWIST1/2蛋白表达改变；进一步利用Matrigel胶三维培养模型分析MACC1对VM形成能力的影响,并分析沉默TWIST1或TWIST2后VM管状数目的变化。[结果]1)前期研究已成功构建GC裸鼠皮下瘤和转移瘤模型。本研究中发现,oxMACC1明显促进肿瘤增殖及VM管状形成,且上调TWISTl/2蛋白表达；shMACC1抑制肿瘤生长及VM形成,且下调TWIST1/2蛋白表达；在肺转移模型中,VM密度与肺转移灶数目呈正相关；2)在BGC-823和MKN-28两种GC细胞系中,MACC1过表达显著上调TWIST1/2表达,反之,MACC1沉默则有效抑制TWISTl/2表达;3)细胞三维培养条件下,MACC1过表达促进GC细胞形成管状结构,MACC1沉默抑制这种作用；沉默TWIST1或TWIST2均可降低GC细胞形成管状结构的能力。[小结]1) MACC1促进GC动物模型的VM形成和GC细胞形成管状结构;2) MACC1可通过上调TWIST1/2表达促进GC细胞在三维基质中出现VM管道化结构；3)前期研究已证实MACC1通过EMT促进GC细胞侵袭、迁移；在本研究中,我们进一步发现TWIST1/2蛋白是MACC1诱导GC细胞通过EMT途径促进VM形成的重要调节分子。第三部分"HGF/c-Met-TWISTl/2-VE-cadherin/VEGFR2"通路参与MACC1诱导的VM进程[目的]分析MACC1对TWIST1/2转录水平的调控作用;探讨HGF/c-Met信号通路在MACC1诱导GC细胞成管能力中的作用,明确MACC1诱导GC细胞形成VM的分子机制。[方法]利用荧光素酶报告基因分析MACC1对TWIST1/2启动子活性的调控；利用MTT实验分析HGF激动剂(rhHGF)和c-Met抑制剂(PF-04217903)处理GC细胞的使用浓度,以Western blot检测细胞核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达变化；在三维培养模型下,观察HGF激动剂和c-Met抑制剂对GC细胞VM管状结构形成能力的影响；进一步利用qRT-PCR、Western blot、流式细胞学检测在MACC1不同表达的GC细胞中,VE-cadheri、VEGFR2和E-cadherin的表达变化；以免疫组织化学方法观察GC动物皮下瘤及88例人类GC标本中VE-cadherin表达状态,分析其与MACC1二者间的相关性,最后进行统计学分析。[结果]1)在5对GC组织(癌及癌旁)中,癌组织的核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达明显高于癌旁组织;2) MACC1在特殊微环境下可与TWIST1/2启动子区结合并增强其转录活性；3)GC细胞经过24-48小时处理后,与初始细胞数目相比,20μM HGF激动剂诱导BGC-823细胞数量增加25%, MKN-28细胞数量增加15%; c-Met抑制剂分别处理BGC-823和MKN-28细胞,致半数致死量(IC50)浓度分别为22μM和2μM。Western blot结果可见HGF激动剂显著上调核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达；而c-Met抑制剂拮抗这一效应;4)三维培养条件下,HGF激动剂促进GC细胞形成管道化结构,而c-Met抑制剂抑制这一进程；5) MACC1上调VE-cadherin、VEGFR2表达,且下调E-cadherin表达；6) MACC1表达及VM现象均与VE-cadherin (EMT表征蛋白)表达存在显著正相关。[小结]1) MACC1可与TWIST1/2的启动子区域结合并促进二者转录,上调其核内蛋白表达；2)HGF激动剂通过上调核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达,促进GC细胞VM形成,而c-Met抑制剂则拮抗这一作用：3) QRT-PCR、Western blot及流式细胞学分析实验表明：MACC1上调VE-cadherin、VEGFR2表达,下调E-cadherin表达；4)MACC1表达及VM现象,均与VE-cadherin表达具有显著相关性,推测MACC1可能通过EMT调控因子TWIST1/2调节VE-cadherin表达,促使肿瘤细胞向肿瘤相关血管内皮细胞转化,即肿瘤相关血管内皮细胞(Tumor-associated endothelial cells, TAEs),最终形成VM。结论本文通过对人类GC临床标本进行回顾性分析,探讨MACC1表达与VM密度的关系,发现MACC1通过上调TWIST1/2表达促进VM形成,证明"HGF/c-Met-TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"是MACC1诱导胃癌VM进程的可能分子机制。其中包括所涉及的MACC1结合TWIST1/2启动子以及相应的组织、细胞在分子和功能学多角度的评价。