雌二醇在系统性红斑狼疮发病中的作用实验目的系统性红斑狼疮（systemic erythematosus lupus，SLE）是一种自身免疫性疾病，在我国约有100万患者，病变累及多系统，多器官，病程反复迁延，大多成为终身疾患，严重影响人类的身体健康和心理健康。SLE以血清中出现抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）和组蛋白抗体（antihistone antibody，AHA）等多种自身抗体以及病变累及肾脏为特点。采用免疫荧光或电镜等复杂技术进行病理检查发现100％患者累及肾脏，形成狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN），预后不良。但SLE的发生与遗传背景、女性激素、环境影响等多种因素有关，至今病因不清，临床表现多样，诊治比较困难。所以，积极探讨SLE发病机理甚为必要。动物模型是研究SLE的发病机制、诊断治疗的必要工具。现在应用的红斑狼疮模型鼠主要有两类，一类是自发形成SLE，另一类是人工诱导形成。前者发病时间长、病理损害不均一，价格昂贵。后者发病时间短，容易控制，临床表现一致性较高。所以，本实验采用ConA活化的同品系小鼠脾细胞免疫诱导的Balb／c小鼠SLE模型作为研究对象。但是这一方法诱导小鼠发生SLE的机制目前还不清楚，也未见相关报道。SLE患者存在免疫细胞凋亡紊乱，免疫细胞的不正常凋亡可能是导致SLE发生的始动原因。因此本实验通过观察免疫后小鼠脾细胞凋亡及凋亡调控因子Bcl-2和NFκB的改变探讨ConA活化的同系小鼠脾细胞诱导Balb／c小鼠发生SLE的机制。SLE多发于育龄女性，病情随患者的生理状态的不同而发生改变等现象都提示雌性激素与SLE发生发展有关，而雌激素是女性激素的主要形式。目前已经证实多种免疫细胞上都存在雌激素的受体，说明雌激素可以直接作用于免疫系统，调节其免疫功能从而影响自身免疫病的发生发展。但是多数关于雌二醇（estradiol，E2）与SLE相关性的研究，并没有得出一致的结论。本实验采用切除卵巢的上述SLE模型鼠作为研究对象，以减少内源性雌激素的干扰，通过人工注射苯甲酸雌二醇控制体内E2的水平，观察其对SLE发生发展的影响。在SLE的发生、发展过程中，细胞因子网络的变化对病程的演进有着重要的作用。Th1型、Th2型细胞因子比例失调，细胞因子分泌增加或减少，细胞因子间相互的拮抗或协同作用等都将影响SLE的发生发展过程。关于Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β）、Th2型细胞（IL-4、IL-5、IL-10）因子在SLE中的变化的研究较多，并且普遍认为SLE是Th2优势疾病，但仍存在争议。而关于炎性细胞因子IL-1、IL-8、TNF-α的研究较少，但已有报道这些促炎性细胞因子在SLE中存在分泌水平变化，提示这些细胞因子参与了SLE的病理学改变。本实验通过观察Balb／c小鼠SLE模型的促炎性细胞因子的变化和E2对其产生水平的影响，进一步揭示E2在SLE的发病中的作用机制。另外，SLE患者存在雌激素代谢异常，雌激素代谢异常在SLE发生发展中起一定作用。而催化不同组织中雄激素向雌激素转化的限速酶就是芳香酶。已经有研究表明大鼠垂体芳香酶表达存在性别差异，与动情周期有关，并且受雌激素的负反馈调节。还有研究表明类风湿滑膜炎患者局部炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1）的升高可明显刺激外周组织芳香酶活性增强，进而导致局部组织中雄激素低而雌激素高。为此，本实验观察了不同水平的E2对SLE模型小鼠肾脏局部芳香酶mRNA表达的影响，进一步探讨E2可否通过调节芳香酶的活性影响SLE的病理过程。实验方法一、SLE小鼠模型的制备和脾细胞凋亡及相关调控机制的研究1、脾细胞悬液的制备无菌取Balb／c小鼠脾脏制备脾细胞悬液，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调节细胞浓度为2×10⁶／ml，加入ConA，使其终浓度为5μg／ml。将加有ConA的脾细胞悬液置37℃、5％CO₂培养箱内孵育72h后，收集活化脾细胞并以生理盐水调节脾细胞浓度为2×10⁸／ml，同样条件制备未用ConA刺激的脾细胞悬液作为对照。2、动物分组及处理取72只小鼠随机分为3组，每组24只：（1）SLE模型诱导组（model induced group，MI组）取ConA刺激活化的脾细胞5×10⁷／只皮下注射，每周1次，连续3次。（2）脾细胞对照组（cell control group，CC组）给正常小鼠在相同时间、相同部位注射相同剂量的未经ConA活化的同系脾细胞悬液。（3）正常对照组（normal control group，NC组）给正常小鼠在相同时间、相同部位注射相同体积的生理盐水。3、SLE模型鼠的鉴定（1）样品的收集于初次免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每组分别取出6只小鼠，用乙醚麻醉后摘除眼球采血，析出血清用于自身抗体ANA和AHA的测定。无菌取出双侧肾脏，分为3部分，第1部分离体后立即置于液氮中，用于制备冰冻切片进行直接荧光抗体检测；第2部分切取1mm³肾皮质置于3％戊二醛固定液中固定，用作制备超薄切片进行透射电镜观察；第3部分肾组织置于10％甲醛中固定，用于制备石蜡切片进行HE染色。（2）SLE模型鼠外周血中ANA、AHA的测定采用ELISA法检测，按试剂盒说明书进行。（3）SLE模型鼠肾脏病理改变的观察①光学显微镜观察肾脏形态学的变化：常规制备小鼠肾组织石蜡切片，HE染色，用中性树脂封固，光学显微镜下观察并对肾小球病理学改变的严重程度进行打分。②荧光显微镜观察肾脏IgG类IC的沉积：采用直接免疫荧光法，简述如下：无菌取小鼠肾脏进行冰冻切片，滴加羊抗小鼠FITC-IgG抗体于组织切片上，置37℃孵育30min，在荧光显微镜下观察肾小球内有无IgG沉积及分布部位、荧光强度。③电子显微镜观察肾脏超微结构的改变：肾脏经3％戊二醛磷酸预固定、1％锇酸后固定、812环氧树脂包埋、超薄切片、电子染色后，透射电镜观察肾小球基底膜、足突的变化及有无电子致密物沉积。4、SLE模型鼠脾细胞凋亡的检测于实验第4wk，无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，PBS洗涤并调节细胞密度为2×10⁷／ml，取细胞悬液进行涂片，4％多聚甲醛固定后采用Tunel试剂盒检测细胞凋亡，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行操作，荧光显微镜下观察并拍照，采用NIS-Elements BR2.30图像分析系统计数阳性细胞百分率。5、SLE模型鼠脾细胞Bcl-2和NFκB的检测采用免疫细胞化学方法，简述如下：脾细胞收集及细胞涂片固定同上（4、SLE模型鼠脾细胞凋亡的检测），3％H₂O₂去离子水37℃5min以去除内源性过氧化物酶，分别滴加1∶200稀释的一抗（兔抗鼠Bcl-2和鼠抗鼠NFκB）50μl，4℃过夜，PBS洗涤后，再分别滴加相应的酶标二抗（抗兔和抗鼠）1滴，30℃25min，洗涤后，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，采用图像分析系统计数阳性细胞百分率。二、E2对Balb／c小鼠SLE模型诱导的影响1、动物分组及处理Balb／c近交系小鼠168只，随机分为7组，每组24只。A组：假手术对照组，切除双侧卵巢周围的两小块脂肪作对照；B组：手术对照组，进行双侧卵巢切除作对照；C组：假手术模型组，假手术后进行SLE模型诱导；D组：手术模型组，双侧卵巢切除后进行SLE模型诱导：E组：E2小剂量组；F组：E2中剂量组；G组：E2大剂量组。E组、F组和G组小鼠切除双侧卵巢后，进行SLE模型诱导，并且分别肌肉注射E2 0.1μg／小鼠、1μg／小鼠和10μg／小鼠，隔日1次，直至开始相应指标检测。A、B、C、D组小鼠隔日肌肉注射相当于E2容量的花生油作对照。2、样品的收集于初次细胞免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每组分别取出6只小鼠用乙醚麻醉，摘除眼球取血，析出血清，用于ANA、AHA及E2测定。无菌取肾脏，分为4部分，第1部分肾组织每100mg加入0.5ml PBS液体匀浆，离心后取上清，用于测定肾组织E2。第2部分取Imm³肾皮质加入3％的戊二醛磷酸固定液中固定，用于电镜观察肾脏超微结构的改变。第3部分迅速冻于液氮，后移至-70℃保存，用于制备冰冻切片进行直接荧光抗体法检测IgG类IC的沉积。第4部分于10％甲醛中固定，进行石蜡切片HE染色。3、外周血中和肾组织中E2及外周血中ANA、AHA的测定采用ELISA法检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。4、肾脏病理学改变的观察（1）光学显微镜观察肾脏形态学改变常规制备小鼠肾组织石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察肾小球病理改变的严重程度。（2）荧光显微镜观察肾脏IgG类IC的沉积采用直接荧光抗体法于荧光显微镜下观察肾小球内有无IgG类IC的沉积及其分布部位、荧光强度。（3）电子显微镜观察肾脏超微结构的改变透射电镜观察肾小球基底膜、足突的变化及有无电子致密物沉积。三、E2对SLE模型鼠促炎性细胞因子及肾脏芳香酶表达的影响1、动物分组及处理同二、1．。2、样品的收集于脾细胞初次免疫后第4wk、第6wk、第8wk、第10wk，各组分别取出6只小鼠，用乙醚麻醉后，摘除眼球取血，析出血清，用于测定外周血中促炎性细胞因子。无菌取肾脏，一部分进行匀浆，离心后取肾组织匀浆上清用于促炎性细胞因子的测定，另一部分用于检测肾组织芳香酶mRNA的表达。3、外周血中及肾组织中促炎性细胞因子（IL-1、IL-8和TNF-α）的检测，采用ELISA法，按试剂盒说明书进行。4、肾组织芳香酶mRNA表达的检测采用RT-PCR法无菌取Balb／c小鼠肾脏，采用酸性异硫氢酸胍／酚／氯仿抽提法提取总RNA，用OligdT引物合成单链cDNA。PCR扩增芳香酶cDNA，引物为sense5’-GTATGAACGATCCGTCAAGG-3’，Antisense 5’-AGCCGTCAATTACGTCATCC-3’。反应体系为50μl，含10μl cDNA、0.5μl Taq酶。反应条件为：95℃预变性5min，PCR三温循环（94℃30sec、55℃1min、72℃1min）共25个循环，末次延伸10min。1.5％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。实验结果一、SLE小鼠模型的制备和脾细胞凋亡及相关调控机制的研究经检测发现MI组24只小鼠外周血中均出现ANA和AHA，肾脏发生病理学改变，而CC和NC组小鼠外周血中未检出自身抗体，肾组织完好。具体检测结果如下：1、SLE模型鼠外周血中ANA和AHA水平的变化MI组小鼠外周血中出现ANA和AHA，自身抗体自第1次接种活化脾细胞后第4wk出现，且逐渐升高，到第10wk开始下降。而CC和NC组小鼠外周血中中未测得ANA和AHA。2、SLE模型鼠肾脏病理的改变（1）光学显微镜下肾脏形态学的变化MI组小鼠出现肾小球肾炎的表现，炎性改变程度随时间延长而加剧，而CC组和NC组小鼠肾小球结构清晰，无异常病理改变。（2）荧光显微镜检查IgG类IC沉积的变化肾脏冰冻切片直接荧光抗体检测发现MI组大多数肾小球内都有被FITC着色的斑块状沉积物，可见肾小球毛细血管襻免疫复合物沉积，呈连续性荧光分布，随着活化脾细胞免疫时间延长，可见肾脏冰冻切片荧光滴度增强。而CC组和NC组小鼠肾脏未见IgG类免疫复合物的沉积，直接荧光染色微弱、无特异性，肾小球轮廓不清。（3）电子显微镜下超微结构的变化MI组小鼠肾小球滤孔膜融合，内皮细胞脱落，系膜细胞插入基膜，基膜厚度弥漫不均，可见基膜区有电子致密物沉积。检测发现MI组小鼠第10wk肾脏超微结构改变最严重。CC组和NC组基底膜厚度均匀，滤过屏障结构完好，未见电子致密物沉积。3、SLE模型鼠脾细胞凋亡的变化与NC组和CC组相比较，MI组初次免疫后第4wk，其脾细胞凋亡百分率（0.89±0.23）明显降低。4、SLE模型鼠脾细胞Bcl-2和NFkappaB表达的改变与NC组和CC组相比较，MI组脾细胞Bcl-2和NFκB的表达细胞百分率（分别为89.78±7.62和52.12±8.87）明显增高。二、E2对Balb／c小鼠SLE模型诱导的影响1、SLE模型鼠外周血中及肾组织E2水平的变化B组外周血中E2水平明显降低，与A组相比较差异显著（P＜0.01）。但B组外周血中E2随着时间逐渐升高，第10wk与第4wk相比较有明显差异（P＜0.01）。C组和D组外周血中E2的水平分别高于A组和B组（P＜0.01），说明SLE炎症状态下，外周血中E2水平升高。E、F、G组相当于超过机体生理水平的3个剂量组，由于激素在体内的累积作用，无论血中，还是肾组织中E2均逐渐升高。3组外周血中E2水平在第4wk、第6wk、第8wk和第10wk两两差异均非常显著（P＜0.01）。小鼠肾组织E2的变化与外周血中E2水平的变化基本保持一致，但是肾组织E2明显低于外周血中E2。2、E2对SLE模型鼠外周血中ANA和AHA产生的影响经同系活化脾细胞免疫的Balc／b小鼠外周血中均出现ANA和AHA，C组和D组自身抗体在第8wk达到最高峰，然后降低，符合典型免疫应答的过程。而肌肉注射E2的E组、F组和G组到第10wk仍未见自身抗体的降低，可见E2是自身抗体产生的明显的促进因素，这可能是女性育龄多发SLE的一个重要原因。A组及B组小鼠外周血中均未检出ANA和AHA。3、E2对SLE模型鼠肾脏病理改变的影响（1）光学显微镜下肾脏形态学的变化活化脾细胞免疫的小鼠第4wk即见肾脏病理改变，主要表现为肾小球肾炎，病理改变以G组最重，以下依次是F组与E组，C组和D组病变相仿，各组小鼠肾脏病理改变随时间逐渐加重。A组和B组小鼠。肾脏并未发生病理改变。（2）荧光显微镜检查IgG类IC的沉积的变化经活化同系脾细胞免疫的Balc／b小鼠肾脏冰冻切片大多数肾小球内都有被FITC着色的斑块状沉积物，其荧光强度值逐渐增加，以G组最为显著。A组和B组小鼠肾脏未见IgG类免疫复合物的沉积，直接荧光染色微弱、无特异性，肾小球轮廓不清。（3）电子显微镜下超微结构的变化A组和B组小鼠肾脏基底膜厚度均匀，滤过屏障结构完好。C组、D组、E组、F组和G组可见灶性或弥漫性轴突融合、内皮细胞呈条索状脱落到管腔内、系膜细胞增生、基膜分层、灶性松散、厚度弥漫不均，可见基膜区有电子致密物沉积，以G组为甚。三、E2对SLE模型鼠促炎性细胞因子及肾脏芳香酶表达的影响1、E2对SLE模型鼠外周血中及肾组织促炎性细胞因子水平的影响（1）外周血中和肾组织IL-1水平的变化与A组相比较，B组小鼠外周血中IL-1明显升高（P＜0.01）。C组和D组在第4wk、第6wk升高，但于第8wk、10wk逐渐降至A组水平。E组、F组和G组逐周升高，3组的第10wk与第4wk相比较差异均显著（P＜0.01）。肾组织IL-1的变化趋势与外周血中一致，但比外周血中IL-1水平高出很多，提示促炎性细胞因子主要在局部产生并在局部发挥作用。（2）外周血中与肾组织IL-8水平的变化外周血中IL-8变化不明显，只有C组和D组在第4wk、第6wk高于A组（P＜0.01），并于第8wk、第10wk降至A组水平，E组、F组、G组随时间变化不大，3组间无显著性差异（P＞0.05）。同A组相比较，B组、C组、D组、E组、F组和G组肾组织IL-8均明显升高（P＜0.01），B组随时间变化不大，C组和D组逐周降低，但至第10wk仍高于A组水平（P＜0.01）。E、F、G组肾脏IL-8逐周升高，第10wk肾组织IL-8达到最高水平，以G组最为显著。（3）外周血中与肾组织TNF-α水平的变化与A组比较，B组外周血中TNF-α水平明显升高（P＜0.01），而其余各组均明显降低（P＜0.01），3个剂量组外周血中TNF-α水平的差异不明显（P＞0.05）。与A组相比较，其余各组肾组织匀浆TNF-α均明显升高（P＜0.01），以D组最为明显，E、F、G组3组间差异不显著（P＞0.05）。2、E2对SLE模型鼠肾脏芳香酶mRNA表达的影响扩增后得到GAPDH 530bp和芳香酶基因428bp两个片段，GAPDH为内参照。图像分析结果显示：A组肾脏芳香酶mRNA低表达，而B组芳香酶mRNA表达明显增加，与A组相比较具有显著性差异（P＜0.01）。与A组和B组相比较，C组和D组肾脏芳香酶mRNA表达增加（P＜0.01）。说明SLE炎症状态可导致肾脏芳香酶mRNA的高表达。E组、F组和G组均出现了GAPDH和芳香酶两条带，且随着E2剂量的加大，肾脏芳香酶mRNA表达增高，G组与E组相比较差异显著（P＜0.01），而E组和F组之间差异不显著（P＞0.05）。结论1、采用ConA活化的同系脾细胞成功地诱导了Balb／c小鼠SLE动物模型；2、脾细胞凋亡抑制可能是ConA活化的同系脾细胞诱导Balb／c小鼠SLE的始动因素；3、NFκB上调凋亡抑制因子Bcl-2可致SLE小鼠模型脾细胞凋亡抑制：4、卵巢摘除可明显降低体内E2水平，但不能阻止ConA活化的同系脾细胞对Balb／c小鼠SLE模型的诱导；5、E2可明显促进ConA活化的同系脾细胞诱导Balb／c小鼠SLE的发生发展；6、E2通过调节促炎性细胞因子分泌促进SLE的发生发展；7、E2通过增强SLE模型鼠肾脏芳香酶的表达影响SLE的病理过程。