目的:在建立支气管哮喘大鼠模型基础上,通过动物实验,探讨咳喘宁对哮喘大鼠免疫调节的作用及其机制,为治疗支气管哮喘临床用药提供实验依据。方法第一部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠Th1∕Th2细胞因子的调节作用及病理形态学的影响清洁级SD大鼠40只,雌雄各半,体重180-200g。动物随机分为5组,即正常组、模型组、咳喘宁高剂量组(简称高剂量组)、咳喘宁低剂量组(简称低剂量组)、桂龙咳喘宁对照组(简称桂龙咳喘宁组),每组8只。各治疗组均从第1次哮喘激发开始(造模第3周)至处死前每天灌胃给药,连续4周,剂量分别为:高剂量组27g/Kg,低剂量组13.5g/Kg,桂龙咳喘宁组0.41 g/Kg,正常组、模型组予0.5%的羧甲基纤维素钠液灌胃,一日一次。参考文献,除正常组外,于实验第1天和第8天各组大鼠腹腔内注射10%卵蛋白、氢氧化铝混合液1ml,腰部两侧各取1点,每点皮下注射0.5 ml,共计2 ml,使大鼠致敏。第15天起用3%卵蛋白50 ml喷雾激发大鼠哮喘发作,雾化流量为5ml∕min,每次20min,隔日一次,共激发4周。以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。病理组织学观察:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,苏木精-伊红HE染色,镜下观察病理学改变,采用NYD1000型计算机图象处理软件。IL-4和IFN-γ水平的检测:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺上叶,称重后移入玻璃匀浆管中,加入2倍肺组织重量的生理盐水,充分研碎,使组织匀浆化。制备好的匀浆,3500r/min离心10 min,提取上清液分装。采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定IL-4和IFN-γ水平。用抗IL-4(IFN-γ)单克隆抗体包被酶标板,PBS洗板4次;用1%BSA(牛血清白蛋白)加入酶标板(200μl∕孔),4oC过夜;然后分别加入标本及不同浓度的标准品(100μl∕孔),室温孵育120min,形成免疫复合物连接在板上,PBS洗板4次;加入辣根过氧化物酶标记的抗IL-4单克隆抗体(100μl∕孔),室温孵育60min, PBS洗板4次;加显色剂OPD底物溶液,避光室温10-30 min,出现黄色;加终止液硫酸,混匀,5 min内颜色变深;用酶标仪在490nm处测吸光度OD值,绘制标本曲线,查出标本浓度。数据采用均数±标准差(±s)表示,用SPSS for Windows 11.5统计软件处理,多组比较采用单因素方差分析,然后用Student-Newman-Keuls Test进行每两组间比较,显著性差异水平以0.05和0.01为标准。第二部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠炎性介质NO和ET-1的影响动物分组、模型建立、用药情况以及数据统计方法同前。病理组织学观察:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,苏木精-伊红HE染色,镜下观察病理学改变。并参照文献测量大鼠气道壁的面积,并用气管内周长进行标准化。采用NYD1000型图像分析软件测定完整支气管管腔的内周长(Pi)、管壁面积(WA)、支气管平滑肌的面积,用Pi进行标准化,分别以WA/Pi、支气管平滑肌的面积/Pi表示支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度;同时测定每高倍视野(400倍)的EOS、淋巴细胞数。NO和ET-1含量测定:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺上叶,称重后移入玻璃匀浆管中,加入2倍肺组织重量的生理盐水,充分研碎,使组织匀浆化。制备好的匀浆,3500r/min离心10 min,提取上清液分装。采用硝酸还原酶法测定肺组织NO含量,采用放免法测定肺组织ET-1含量,并用蛋白含量来校正。第三部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠核因子-kB(NF-kB)的影响动物分组、模型建立、用药情况以及数据统计方法同前。气道壁EOS计数:病理组织切片制作同前,采用NYD1000型计算机图象处理软件。选择结构较完整的支气管壁由同一观察者随机选取5个高倍视野(×400)计数支气管壁中浸润EOS数,计算其平均值作为该切片的代表值。NF-kB表达的检测:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定24小时,脱水、石蜡包埋、连续切片,厚4μm,做免疫组织化学ABC法染色。一抗为小鼠抗大鼠P65单克隆抗体(F-6)、二抗为生物素化马抗小鼠IgG,主要操作步骤如下:(1)石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,PBS漂洗5 min×2次;(2)3%的双氧水甲醇溶液室温孵育5~10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS洗涤3次;(3)热修复抗原:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),微波炉加热至沸腾后断电,间隔5-10 min,反复1-2次,冷却后PBS洗涤2次(4)滴加5%正常山羊血清封闭,室温孵育20 min。倾去多余液体;(5)滴加NF-kBⅠ抗(1:100稀释)湿盒孵育,4℃冰箱内过夜,PBS洗涤5 min×2次;(6)滴加生物素标记的二抗工作液,37℃孵育45 min,PBS洗涤5 min×2次;(7)滴加试剂SABC(1:100稀释), 37℃孵育20 min,PBS洗涤5 min×2次;(8)DAB显色5~15 min,终止呈色反应;(9)苏木素衬染,常规裱片、干燥、脱水、透明、封片。在光学显微镜下观察,选择结构较完整的支气管壁由同一观察者随机选取5个高倍视野(×400)计算支气管壁中胞核NF-kB阳性的细胞百分数,取平均值作为该切片的代表值。第四部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠嗜酸粒细胞凋亡和相关基因蛋白bcl-2和bax表达的影响动物分组、模型建立、用药情况以及数据统计方法同前。组织标本制作:动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取右肺中叶4%多聚甲醛固定24小时,脱水、石蜡包埋、连续切片,厚4μm,分别做HE染色、TUNEL标记和免疫组织化学ABC法染色。嗜酸粒细胞凋亡检测:本实验参照TUNEL试剂盒说明进行操作,主要步骤如下:(1)石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,PBS(0.01M,pH7.4)漂洗5 min×2次;(2)蛋白酶K(2mg/L)37℃消化15 min, PBS漂洗5 min×3次;(3)DNA平衡液平衡阳性对照片2 min后,加入DNase I, 37℃反应10 min;(4)实验组和阳性对照片分别加入TUNEL工作液(1:19稀释)50μl, 37℃孵育45 min,PBS漂洗5 min×3次;(5)加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗荧光素抗体50μl, 37℃孵育30 min,PBS漂洗5 min×3次;(6)经BufferⅢ平衡后,NBT/BCIP显色,室温下暗处显色至阳性对照显色良好时终止呈色反应;(7)缓冲甘油(PBS:甘油=1:3)封片和观察。bcl-2和bax蛋白表达的检测:采用免疫组织化学ABC法染色(方法同前)。结果判定及图象处理:光学显微镜下观察,凋亡的嗜酸粒细胞为蓝紫色双核或单核,位于胞核内,胞浆不着色。Bcl-2和Bax蛋白染色呈棕黄色颗粒,位于细胞浆内。每张切片高倍镜下(×400)由同一观察者随机选取5个视野,分别计算支气管壁和肺组织嗜酸粒细胞数量(HE)染色及嗜酸粒细胞凋亡指数(TUNEL法,凋亡嗜酸粒细胞占相应嗜酸粒细胞的百分比,AI),以及胞核bcl-2和bax强阳性的细胞百分数,取平均值作为该切片的代表值。第五部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织IL-5 mRNA表达的影响动物分组、模型建立、用药情况以及数据统计方法同前。动物麻醉完全后,开胸迅速结扎右主支气管,取近肺门处的右肺组织约50-100mg,放入匀浆器内,加入1ml的Trizol用匀浆器匀浆,采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织IL-5 mRNA表达的变化。结果第一部分:咳喘宁对哮喘大鼠Th1∕Th2细胞因子的调节作用及病理形态学的影响1咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管-肺组织病理学的影响正常组:大鼠肺组织支气管内及周围无明显炎性细胞浸润,管壁完整,管壁和平滑肌厚度正常,组织黏膜未见充血水肿,肺泡间隔狭窄,肺泡腔清亮宽敞。模型组:支气管壁、管腔内及血管、支气管周围有大量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,支气管粘膜水肿、增厚、上皮脱落、微血管渗漏、管腔内分泌物增多,基层细胞增生、平滑肌增厚,组织黏膜充血水肿,肺泡间隔变宽,肺泡腔变狭窄。桂龙咳喘宁组:肺组织嗜酸性粒细胞及其它炎性细胞浸润略微减少,管壁和平滑肌厚度略微减少,组织充血水肿现象略微减轻。咳喘宁低剂量组:肺组织嗜酸性粒细胞及其它炎性细胞浸润减少,管壁和平滑肌厚度减少,组织充血水肿现象减轻,肺泡腔变宽,肺泡间隔变窄。咳喘宁高剂量组:肺组织嗜酸性粒细胞及其它炎性细胞浸润明显减少,几乎消失;管壁和平滑肌厚度明显减少,组织充血水肿现象明显减轻,肺泡腔变宽,肺泡间隔变窄。2咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织匀浆IL-4含量的影响与正常组比较,模型组大鼠肺组织IL-4含量明显升高,具有非常显著性差异(P<0.01);与模型组比较,各治疗组均可降低IL-4含量,咳喘宁高剂量组效果更为明显,具有非常显著性差异(P<0.01);咳喘宁低剂量组和桂龙咳喘宁组,具有显著性差异(P<0.05);与桂龙咳喘宁组比较,咳喘宁高剂量组IL-4含量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)。3咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织匀浆IFN-γ含量的影响与正常组比较,模型组大鼠肺组织IFN-γ含量较正常组有所升高,但无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,各治疗组均可升高IFN-γ含量,咳喘宁高剂量组效果更为明显,具有非常显著性差异(P<0.01);咳喘宁低剂量组和桂龙咳喘宁组可升高IFN-γ含量,具有显著性差异(P<0.05);与桂龙咳喘宁组比较,咳喘宁高剂量组IFN-γ含量明显增高,具有显著性差异(P<0.05)。4咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织IFN-γ∕IL-4比值的影响与正常组比较,模型组大鼠肺组织IFN-γ∕IL-4比值明显降低,具有非常显著性差异(P<0.01);与模型组比较,各治疗组均可升高IFN-γ∕IL-4比值,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01);咳喘宁高剂量组效果更为明显,具有非常显著性差异(P<0.01);与桂龙咳喘宁组比较,咳喘宁高剂量组IFN-γ∕IL-4比值明显增高,具有显著性差异(P<0.05)。第二部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠炎性介质NO和ET-1的影响1咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管-肺组织病理学的观察及定量分析:正常组大鼠肺组织偶见炎细胞浸润,管壁完整,粘膜未见充血水肿,管壁和平滑肌厚度正常;模型组大鼠可见支气管壁及血管、支气管周围有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润(P<0.01),支气管粘膜水肿、增厚、上皮脱落、微血管渗漏、管腔内分泌物增多,基层细胞增生、平滑肌增厚(P<0.01);与模型组比较,各治疗组嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润明显减少(P<0.01),肺组织充血、水肿现象减轻,管壁和平滑肌厚度明显减少(P<0.01);高低剂量组病理组织学指标改善优于桂龙咳喘宁组(P<0.05或P<0.01)。2咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织NO含量的影响与正常组比较,模型组大鼠肺组织NO含量明显升高,具有非常显著性差异(P<0.01);与模型组比较,各治疗组均可降低NO含量,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01);咳喘宁高剂量组效果更为明显,具有非常显著性差异(P<0.01);与桂龙咳喘宁组比较,咳喘宁高剂量组NO含量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)。3咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织ET-1含量的影响与正常组比较,模型组大鼠肺组织ET-1含量明显升高,具有非常显著性差异(P<0.01);与模型组比较,各治疗组均可降低ET-1含量,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01);咳喘宁高剂量组效果更为明显,具有非常显著性差异(P<0.01);与桂龙咳喘宁组比较,咳喘宁高剂量组NO含量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)。第三部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠核因子-kB(NF-kB)的影响1咳喘宁对支气管哮喘大鼠气道壁EOS浸润情况比较模型组大鼠的气道壁EOS计数较正常组显著增加(P<0.01),治疗组大鼠的气道壁EOS计数较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高低剂量组改善更为显著(P<0.01),其优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。2咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织NF-kB表达的影响正常组大鼠肺组织及气道壁见少许NF-kB阳性表达细胞,模型组大鼠肺组织及气道壁中胞核表达NF-kB的细胞比例显著高于正常组,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物(P<0.01),而治疗组肺组织及气道壁中胞核阳性细胞的比例显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高低剂量组改善更为显著(P<0.01),其优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。第四部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠嗜酸粒细胞凋亡和相关基因蛋白bcl-2和bax表达的影响1咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织EOS凋亡指数的影响正常组大鼠肺组织及气道壁极少EOS浸润。模型组大鼠的气道壁EOS计数较正常组显著增加(P<0.01),治疗组大鼠的气道壁EOS计数较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高低剂量组改善更为显著(P<0.01),其优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。正常组大鼠肺组织及气道壁极少EOS凋亡,治疗组大鼠的气道壁EOS凋亡指数较模型组显著增高(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高剂量组改善更为显著(P<0.01),其作用优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。2咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织bcl-2蛋白表达的影响正常组大鼠肺组织及气道壁见少许bcl-2阳性表达细胞,模型组大鼠肺组织及气道壁中胞浆表达bcl-2的细胞比例显著高于正常组,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物(P<0.01),而治疗组肺组织及气道壁中胞浆阳性细胞的比例显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高剂量组改善更为显著(P<0.01),其优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。3咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织bax蛋白表达的影响正常组大鼠肺组织及气道壁见较多bax阳性表达细胞,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物。模型组大鼠肺组织及气道壁中胞浆表达Bcl-2的细胞比例显著低于正常组,表现为较浅的黄褐色颗粒状物(P<0.01),而治疗组肺组织及气道壁中胞浆阳性细胞的比例显著高于模型组(P<0.01),以咳喘宁高剂量组改善更为显著,其优于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。第五部分:咳喘宁对支气管哮喘大鼠IL-5 mRNA表达的影响哮喘模型组肺组织IL-5 mRNA表达较正常组明显增高,与模型组比较,各用药组肺组织IL-5 mRNA的表达明显降低(P<0.05或P<0.01),以咳喘宁高剂量组更为显著(P<0.01);咳喘宁高剂量组IL-5 mRNA表达含量明显低于桂龙咳喘宁组(P<0.01)。结论1咳喘宁能有效地改善支气管哮喘肺组织病理改变,减少肺组织EOS浸润,减轻组织充血、水肿现象,减少支气管管壁和平滑肌厚度,有效地减轻哮喘气道炎症及气道重塑。2咳喘宁能显著降低支气管哮喘大鼠肺组织IL-4的含量,提高IFN-γ的含量,提高IFN-γ∕IL-4比值,有效地调节哮喘细胞因子网络系统,改善哮喘气道炎症。3咳喘宁能显著降低支气管哮喘大鼠肺组织NO和ET-1的含量,减少哮喘炎性介质的分泌,改善哮喘气道炎症及气道重塑。4咳喘宁能显著降低支气管哮喘大鼠肺组织NF-kB的表达,通过调整信号传导途径,促进EOS凋亡,改善哮喘气道炎症。5咳喘宁能显著降低支气管哮喘大鼠肺组织bcl-2蛋白的表达,升高bax蛋白的表达,通过调整凋亡相关基因的表达,促进EOS凋亡,有效地改善哮喘气道炎症。6咳喘宁能显著降低支气管哮喘大鼠肺组织IL-5 mRNA的表达,从转录水平降低相关细胞因子含量,减少肺内EOS浸润,促进EOS凋亡,有效地改善哮喘气道炎症。