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[背景和目的]肠屏障损伤在许多疾病的发生发展和转归中发挥重要作用,其导致的微生物移位可引起严重的炎症反应,甚至导致死亡,尤其是在艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的进程中。艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染人体后首先攻击胃肠道,引起肠屏障损伤,进而导致微生物移位,微生物移位引起的免疫活化是增加非艾滋病相关并发症发生率,降低慢性感染期患者生活质量的主要原因,更是推动AIDS疾病进程加速患者死亡的重要因素。因此,开展肠道屏障损伤的分子机制研究,寻找肠屏障损伤修复的治疗靶点,对于提高患者生活质量,延缓疾病进程,延长患者生命,意义深远。谷氨酰胺(Glutamine,Gln)作为重要的免疫营养素,对肠黏膜屏障功能的维护至关重要,当谷氨酰胺缺乏时,会出现肠屏障功能严重受损,但是人们对受损肠粘膜的异常谷氨酰胺代谢知之甚少,丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体-2(Alanine,serine,cysteine-preferring transporter 2,ASCT2)是机体最重要的 Gln 转运载体,广泛分布于代谢旺盛的组织中,如肠道、脂肪和肿瘤组织。现有资料表明,ASCT2可通过影响肿瘤细胞的增殖和凋亡促进肿瘤恶化,但是ASCT2在肠屏障损伤和修复中究竟发挥怎样的作用还不得而知。前期工作发现,HIV/AIDS患者受损的肠黏膜中ASCT2低表达,提示其可能与患者的肠屏障损伤及修复存在一定联系。细菌产物脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)进入肠道固有层诱发炎症反应导致肠上皮细胞大量异常凋亡,是导致肠屏障损伤的主要原因。本研究将构建LPS损伤肠上皮细胞模型,以ASCT2为中心,研究其在LPS诱导的肠屏障损伤修复中的生物学功能以及相关的调控机制,为肠屏障损伤的基因靶向治疗提供新的思路。[方法]建立LPS损伤肠上皮细胞模型,实时荧光定量PCR检测ASCT2在LPS损伤肠上皮细胞模型中的表达情况;过表达/干扰ASCT2探索ASCT2在LPS导致肠上皮细胞损伤模型中的生物学功能;高通量的基因芯片技术用于分析ASCT2异常表达对整个转录组的影响并寻找ASCT2可能调控的信号通路以便后续进行验证;谷氨酰胺缺失及补回实验,用于研究Gln对LPS损伤细胞的修复作用以及Gln对ASCT2的调控作用;生物信息学预测可能调控ASCT2的miRNA,根据前期芯片结果筛选在HIV/AIDS患者肠粘膜中表达差异最显著的miRNA作为进一步研究的对象;使用miRNA模拟物及抑制物,研究该miRNA对ASCT2的调控作用及对LPS导致的肠上皮细胞损伤表型影响;荧光素酶报告基因实验验证miRNA对ASCT2的靶调控作用。[结果]1.与对照组相比,100 ng/ml LPS损伤组CCC-HIE-2细胞增殖能力显著下降(P<0.05),凋亡率明显增加(P<0.05),使用100 ng/ml LPS作为造模条件。2.与对照组相比,100 ng/ml LPS损伤组CCC-HIE-2中ASCT2的表达显著下调(P<0.05)。3.ASCT2的沉默可以抑制LPS损伤细胞增殖能力,促进细胞凋亡(P<0.05);相反的,过表达ASCT2则可以增加细胞的增殖能力,并减少细胞凋亡,修复LPS造成的损伤(P<0.05)。4.对ASCT2过表达的LPS损伤CCC-HIE-2细胞进行mRNA芯片分析,检测到20705个差异mRNA。其中变化倍数(Fold change)>2倍的1066个mRNA。在 1066 个 mRNA 中,732 个(P<0.05 和 FDR<0.05)发生上调,334 个(P<0.05和FDR<0.05)发生下调。GO功能富集分析提示ASCT2的异常表达可能影响多细胞生物发育,细胞增殖,B细胞介导的免疫应答、免疫球蛋白介导的免疫应答等多种细胞功能,KEGG信号通路分析提示ASCT2的异常表达可能与细胞因子-细胞因子受体相互作用,PI3K-Akt-mTOR信号通路,蛋白质消化吸收、脂肪消化吸收及甘油磷脂代谢相关通路等密切相关。5.对PI3K-Akt-mTOR信号通路进行验证发现,过表达ASCT2后PI3K-Akt-mTOR信号通路中的关键分子Akt、mTOR及P70S6K的表达明显上调(P<0.05),但PI3K的表达无明显变化(P>0.05),而沉默ASCT2后Akt、mTOR及P70S6K的表达明显下调(P<0.05),PI3K的表达无变化(P>0.05)。6.随培养基中谷氨酰胺浓度的增加,ASCT2的表达逐渐上调,LPS损伤CCC-HIE-2细胞的凋亡显著减少,但是过高浓度的Gln反而会诱导细胞凋亡。7.使用miRTarBase、TarBase、TargetScan三个数据库预测可能调控ASCT2的 miRNAs,取交集,共得到三个 miRNA,hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-331-3p,其中 hsa-miR-125b-5p 在 HIV/AIDS 患者受损肠粘膜的 miRNAs基因芯片中差异最显著,作为进一步研究的对象。8.对hsa-miR-125b-5p进行靶基因预测,取交集筛选到35个可能的靶基因(ASCT2为其中之一),进行GO分析,发现靶基因集合的生物学过程主要富集在细胞生长和/或维持、细胞凋亡、细胞成熟及增殖等;KEGG信号通路分析提示其靶基因涉及的信号通路主要有PI3K-Akt-mTOR信号通路、p53通路、S1P通路等。同样涉及细胞增殖、凋亡及PI3K-Akt-mTOR信号通路,再次从理论上证实了 hsa-miR-125b-5p与ASCT2的靶向关系。9.与对照组相比,hsa-miR-125b-5p模拟物下调ASCT2mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),而hsa-miR-125b-5p抑制物则引起ASCT2 mRNA和蛋白质表达水平上调(P<0.05),hsa-miR-125b-5p对ASCT2的表达具有负调控作用。双荧光素基因报告实验证实hsa-miR-125b-5p通过靶向ASCT2的3’UTR区域来行使其调控功能。10.与对照组相比,hsa-miR-125b-5p模拟物抑制细胞增殖,诱导凋亡(P<0.05),而hsa-miR-125b-5p抑制物促进细胞增殖,减少凋亡(P<0.05)。添加hsa-miR-125b-5p模拟物PI3K-mTOR信号通路中重要蛋白激酶(Akt、mTOR及P70S6K)的表达受到抑制(P<0.05),PI3K 表达不变(P>0.05),而 hsa-miR-125b-5p抑制物促进Akt、mTOR及P70S6K的表达(P<0.05),PI3K表达不变(P>0.05)。[结论]我们的结果提示hsa-miR-125b-5p通过靶向调控ASCT2的3’UTR区域下调ASCT2的表达,介导Akt-mTOR通路影响LPS损伤肠上皮细胞的增殖和凋亡是导致LPS诱导肠屏障损伤的重要原因之一,而下调hsa-miR-125b-5p或上调ASCT2的表达,可在一定程度上修复LPS造成的CCC-HIE-2细胞损伤,hsa-miR-125b-5p、ASCT2有望成为肠屏障损伤修复的重要靶点。