灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝(Ganoderma lucidum).和紫芝(Ganoderma sinense)的子实体,灵芝三萜和多糖是灵芝的两种主要药理活性组分。灵芝酸A(Ganodericacid A,GAA)是灵芝中含量最为丰富的三萜酸之一,普遍存在于灵芝属植物中。研究报道显示,GAA具有镇痛、抗氧化、肝保护和抗癌等药理活性。作为灵芝的主要活性成分,GAA单体的代谢、体内药代动力学特性和生物利用度仍鲜有报道。灵芝及其制剂在临床及日常保健中被广泛应用,常与其他处方药物同时使用,其是否会和其他药物发生药物相互作用仍然缺乏相关的研究。本文以灵芝酸A为研究对象,从整体动物及细胞水平探讨灵芝三萜在体内的药代动力学过程及吸收转运机制;以灵芝提取物为研究对象,考察灵芝是否存在基于外排转运体和细胞色素P450(CYP450)酶的潜在药物相互作用,为灵芝的合理应用和新药研发提供依据。本论文完成的研究工作主要有以下几个方面:1.GAA代谢产物及代谢途径研究采用HPLC-DAD-MS/MS技术,首次鉴定了 GAA的代谢产物,研究了其主要代谢产物的酶动力学特性。对静脉给予大鼠GAA后采集到的生物样品、以及GAA在大鼠和人肝微粒体孵育体系中的代谢产物进行鉴定,并对其主要代谢产物的酶动力学特性进行考察。从大鼠胆汁、血浆和尿液中共检测鉴定了 37种代谢物;从体外大鼠肝微粒体(RLMs)孵育体系和人肝微粒体(HLMs)孵育体系中分别鉴定了与大鼠体内相同的9和7种代谢物。研究提示GAA在人和大鼠体内的代谢途径具有相似性。GAA可以发生氧化还原羟基化的Ⅰ相代谢和葡萄糖醛酸化磺酸化的Ⅱ相代谢反应,其主要代谢位点为3、7、11、15、23位的羰基或羟基基团和12、20、28(29)位的碳原子。GAA的还原代谢产物在RLMs中的生成速率远大于在HLMs中,且均由CYP3A参与代谢。2.GAA及其代谢产物体内药代动力学研究首先建立了灵敏的用于测定大鼠血浆、胆汁、尿液和脑微透析液中GAA浓度的UFLC-MS/MS分析方法。方法学考察显示,该方法线性良好、灵敏可靠,具有低的检测限(0.25 nmol/L)和定量限(2.00 nmol/L),精密度、准确度、萃取回收率、稳定性等均能满足生物样品分析要求。用所建立的分析方法研究GAA及其主要代谢物灵芝酸C2(C1)、7β,11,15-trihydroxy-3,23-dioxo-lanost-8-en-26-oic acid(C2)、11,15-dihydroxy-3,7,23-trioxo-lanost-8-en-26-oicacid(C3)和灵芝酸B(C4)在大鼠体内药代动力学特性。代谢物浓度以GAA标准曲线进行定量。静脉给予GAA(20mg/kg)后,原型药在体内逐渐消除,同时生成了丰富的代谢物C1-C4。各代谢物在5 min左右均达到Cmax值,分别为2.61、0.17、2.84和0.51 μmol/L,且C1、C2、C4在3-6h左右有明显的重吸收峰。GAA 及其代谢物 C1-C4 的 t1/2 分别为 2.40、13.08、12.35、2.16 和 2.79h,并主要从胆汁中排出,0-24 h在胆汁中的累积排泄率分别为给药剂量的21.37%、18.02%、2.22%、2.33%和0.70%。而GAA在尿液中的累积排泄率仅为2.59%,代谢物C1-C4的累积排泄率之和为0.076%。口服给药(20mg/kg)后,GAA原型药和四个代谢物C1-C4在10-40 min出现第一个血药浓度峰值,且在6-8 h左右均出现重吸收峰。GAA的口服生物利用度为8.68%。静脉给药方式下,GAA可快速通过血脑屏障(Tmax,0.25 h)进入脑组织,其血脑屏障透过率为2.96%,在脑透析液中未检测到其代谢物C1-C4。3.GAA肠道吸收转运机制研究采用Caco-2细胞模型,以UFLC-MS/MS分析方法首次研究了 GAA的肠吸收转运机制。结果表明,GAA在不同浓度(25、50、100 μg/mL)下从肠腔侧(AP)到基底侧(BL)和从BL侧到AP侧的通透量随浓度和时间的增加而相应增加,表观渗透系数PappA→B为(4.30-4.99)×10-7cm/s,Papp B→A为(33.52-37.77)×10-7cm/s,外排率为 6.72-8.79。在 P-糖蛋白(P-gp)抑制剂维拉帕米,多药耐药蛋白(MRP)抑制剂MK571和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)抑制剂潘生丁的干预下,GAA的PappA→B值分别升高至5.79×10-7、12.14×10-7和4.62×10-7cm/s,PappB→A值分别降低至 30.17×10-7、23.55×10-7和 25.57×10-7cm/s,外排显著降低。提示P-gp、MRP和BCRP均参与GAA的外排转运,这可能是GAA 口服生物利用度低的主要原因。4.基于外排转运体的灵芝潜在药物相互作用研究通过Caco-2细胞摄取和跨膜转运实验,研究灵芝(Ganoderma lucidum)提取物及单体成分GAA对外排转运体P-gp、MRP和BCRP功能的影响。细胞摄取实验结果显示,灵芝总提物(GLE)和灵芝三萜提取物(GLT)在浓度为100 μg/mL时,使P-gp底物罗丹明123(Rho)和MRP底物钙黄绿素(Cal)的摄取量显著增加,对P-gp和MRP功能表现出抑制作用;使BCRP的底物Hoechst 33342(Hoe)的摄取量显著降低,对BCRP功能表现出诱导作用。灵芝多糖提取物(GLP)在实验浓度下则对P-gp和MRP功能无显著影响,在浓度为100 μg/mL时对BCRP表现出诱导作用。GAA在实验浓度下对P-gp、MRP和BCRP功能均无显著影响。Caco-2细胞转运模型实验中,用不同浓度GLE和GLT干预Rho的跨膜转运时,Rho从AP到BL的通透量和Papp a→b值均显著增加,从BL到AP的通透量和PappB→A值均显著降低,且表现出剂量依赖性,提示GLE和GLT可以抑制P-gp的外排作用。用不同浓度GLE和GLT干预Cal的外排时,Cal在AP侧的通透量表现出不同程度的降低,在Caco-2细胞单层膜中的累积量表现出不同程度的增加,提示GLE和GLT可以抑制MRP的外排作用。灵芝三萜是灵芝发挥外排转运体抑制作用的主要活性成分。提示灵芝在与外排转运体底物药物合并使用时,可能存在药物相互作用风险。5.基于CYP450酶的灵芝潜在药物相互作用研究选择临床常用药物非那西丁、奥美拉唑、右美沙芬、睾酮、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗分别作为CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9 和 CYP2E1 的探针底物,结合 UFLC-MS/MS 技术对底物代谢物进行检测,以Cocktail探针底物肝微粒体代谢反应体外评价方法,对灵芝提取物和其主要成分GAA的CYP450酶抑制活性进行研究。结果显示,在HLMs中,GLE对CYP2C19、2D6、3A4和2C9表现出微弱的抑制作用,IC50值分别为131.2、164.4、150.5和142.2 μg/mL。GLT的抑制作用略强于GLE,IC50值分别为102.5、116.1、136.4和82.2μg/mL。GLP对6种CYP450酶抑制作用均不明显。在RLMs中,GLT对CYP2C9表现出微弱的抑制作用,IC50值为163.1μg/mL,而对其他酶活性无影响;GLE和GLP对6种CYP450酶均不产生抑制作用。单体成分GAA在1-50 μmol/L的浓度范围内对HLMs和RLMs中的CYP450酶均无抑制作用。