论文部分内容阅读
束缚-浸水应激(restraint water-immersion stress,RWIS)是一种生理和心理上的复合型应激,可在短时间内诱发胃肠机能紊乱(如胃运动亢进、胃酸分泌增多、胃粘液分泌减少、胃粘膜损伤和肠运动加强等)。内侧前额叶(medial prefrontal cortex,mPFC)是哺乳动物最高级别的联合皮层,具有思考记忆、整合信息以及指挥调控的功能。研究发现,应激1h大鼠mPFC内Fos蛋白阳性表达明显增多,表明mPFC核团参与RWIS了过程。那么,在RWIS过程中mPFC内有哪些蛋白发生了变化?这些差异蛋白参与RWIS调控的可能信号通路及分子机制是什么?这些问题仍没有得到解决。此外,突触可塑性对于神经元和神经环路的稳定具有重要作用。在RWIS过程中,mPFC的突触可塑性是否发生改变以及发生怎样的改变仍见未有详细报道。鉴于此,我们提出以下三个问题:1.RWIS导致大鼠mPFC内哪些蛋白的表达量发生改变?这些差异蛋白参与调控的可能机制及信号通路如何?2.RWIS大鼠mPFC内神经元突触的超微结构是否发生改变?3.RWIS大鼠mPFC内突触相关的标志性功能蛋白是否发生改变?为探索上述三个问题,设计以下三部分实验:实验一:将实验动物随机分为对照组(RWIS 0h)和实验组(RWIS 4h),用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术分析两组间大鼠mPFC内差异表达蛋白,进而对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析和IPA分析,探索这些差异蛋白在应激过程可能参与的信号通路以及分子机制。实验二:将实验动物随机分为4组,即RWIS 0h(对照组)、RWIS 1h、RWIS 2h和RWIS 4h组。用高尔基染色法检测RWIS不同时间段mPFC内神经元树突棘密度的变化,用透射电镜超薄切片技术观察RWIS不同时间段mPFC内PSD厚度、突触间隙的宽度、突触曲率以及突触数密度等突触超微结构的变化,探究RWIS不同时间段大鼠mPFC内突触结构可塑性是否发生改变以及发生了怎样的改变。实验三:分组情况同实验二。分别采用免疫组织化学技术、蛋白质免疫印迹技术、RTPCR技术检测应激不同时间段突触标志物——突触后致密物蛋白PSD-95与突触膨体素SYN蛋白及其mRNA相对表达量的变化,进而分析RWIS不同时间段大鼠mPFC的突触功能可塑性是否发生改变以及发生了怎样的改变。实验结果表明:1.iTRAQ技术共鉴定出对照组与RWIS 4h两组差异蛋白129种,其中有88种上调、41种下调。GO分析表明22%(29个)的差异蛋白与神经系统功能直接相关,包括突触可塑性(6个)、轴突形态和生长(12个)、神经发育与凋亡(10个)和神经信号传递(1个)等。KEGG分析发现129种差异蛋白共富集到64条代谢通路,涉及突触囊泡循环、毒理代谢等过程。IPA分析差异蛋白参与137条信号通路,其中只有Rho-GDI信号通路被抑制,整合素信号通路被激活。2.束缚-浸水应激改变了大鼠mPFC的突触结构可塑性。树突棘染色实验发现各应激组与对照组相比单位长度(10um)内树突棘的数量均有显著性减少(P<0.05)。随着RWIS时间的延长,树突棘的密度整体呈先下降再恢复的趋势。其中RWIS 1h组树突棘密度最低(P<0.01),RWIS 2h与RWIS 4h组较RWIS 1h组树突棘的密度有所升高,但无显著性差异(P>0.05)。电镜下可以观察到清晰的细胞结构,如细胞核、线粒体、高尔基体以及突触等。突触后部位电子致密物质明显增厚,在突触前终末端有或多或少的囊泡,呈圆形或椭圆形,聚集在突触前膜处,同时还可以观察到部分与突触前膜融合的囊泡。突触活性区的长度以及突触后致密带的厚度和长度也各有不同。对照组细胞成分轮廓清晰,而应激组轮廓欠清晰,穿孔型突触较多,可以观察到空泡化的线粒体,这说明氧化应激反应对线粒体造成了一定损伤。与对照组相比,RWIS 4h组单位面积突触的数量显著减少(P<0.05),RWIS 1h和RWIS 2h组与对照组相比突触数目有所减少,但差异均不显著(P>0.05)。与对照组相比,RWIS 4h组平直型突触和U型突触所占比例显著减少(P<0.05),而倒U型突触所占的比例显著上升(P<0.05),RWIS 2h和RWIS 1h组与对照组相比均差异不明显(P>0.05)。RWIS 4h组突触前囊泡的数量较对照组明显减少(P<0.05),RWIS 1h和RWIS2h组较对照组则无显著性差异(P>0.05)。突触间隙的宽度随着应激时间的延长呈现先减小后又回增的趋势,其中RWIS 1h和RWIS 2h组较RWIS 0h组突触间隙的宽度均显著降低(P<0.05),但RWIS 4h组与对照组相比则无显著差异(P>0.05)。应激不同时间段,各组PSD的厚度较对照组均有显著性降低(P<0.05),随应激时间的延长,PSD的厚度呈现先降低后恢复的趋势。其中,在RWIS 2h组PSD厚度最低(P<0.01),RWIS 4h组PSD厚度与RWIS 1h和RWIS 2h组相比有升高的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。3.束缚-浸水应激改变了大鼠mPFC的突触功能可塑性。免疫组化结果显示PSD-95蛋白主要在胞浆及膜表面表达,呈棕色或者棕黄色。随着应激时间的延长,PSD-95阳性胞体数量呈现先降低后又恢复的趋势,且各应激组PSD-95阳性胞体数量均较对照组均有显著性减少(P<0.05)。其中RWIS 1h组PSD-5阳性表达量数量最低(P<0.01),RWIS 2h和RWIS 4h组与RWIS 1h组相比,PSD-95表达量有所上升,但与RWIS 1h组无显著性差异(P>0.05)。SYN在整个胞质中均有表达,呈棕黄色。RWIS 4h组与对照组相比,SYN的表达量显著下降(P<0.05),而RWIS 1h和RWIS 2h组与对照组相比略有上升,但无显著性差异(P>0.05)。免疫印迹结果与免疫组化结果一致,PSD-95表达整体呈先降低再升高的趋势。应激组与对照组相比,PSD-95相对表达量均有所降低,并具有显著性差异(P<0.05)。其中,RWIS 1h组PSD-95条带相对表达量最低(P<0.01),RWIS 2h和RWIS 4h组较RWIS1h组PSD-95的表达量增多,但无显著性差异。SYN的表达整体呈现先升高再降低的趋势。RWIS 4h组SYN的相对表达量最低,与应激组相比有显著性差异(P<0.05),RWIS 1h组与RWIS 4h组较对照组SYN的表达略有上升,但无显著性差异。PCR实验结果发现SYN蛋白mRNA相对表达量与免疫组化和免疫印迹结果一致,RWIS 4h组与RWIS 0h组相比,mRNA表达显著下调(P<0.05),RWIS 1h和RWIS 2h组与对照组相比有减少趋势,但无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,RWIS 1h和RWIS 2h组PSD-95蛋白mRNA表达量显著上调(P<0.05),RWIS 4h组mRNA却表达无显著差异(P>0.05)。RWIS 4h组与RWIS 2h组相比,PSD-95蛋白mRNA表达下降(P<0.05),但与RWIS 1h组相比无显著性差异(P>0.05)。综合以上实验,RWIS不同时间段对大鼠mPFC内神经元形成一定程度损伤,mPFC内突触可塑性下调。差异蛋白参与了氧化应激、毒理代谢、转录翻译以及细胞凋亡等生物过程,尤其是NDRG1和NYAP2蛋白在应激中可能参与了机体的保护机制。随RWIS时间的延长,机体启动应激损伤调控机制,mPFC内Rho-GDI信号通路的抑制和整合素信号通路的上调激活可能在神经元的损伤修复以及突触重塑过程中发挥重要功能。