第一部分EZH2介导卵巢癌顺铂耐药目的研究果蝇同源增强子2(EZH2)的表达水平对卵巢癌顺铂耐药的影响。方法1.组织芯片-免疫组化法比较化疗敏感和化疗耐药卵巢癌患者肿瘤组织中EZH2蛋白的表达情况。2.体外周期性给药诱导和建立卵巢癌顺铂耐药细胞株,克隆形成实验验证耐药细胞的耐药性,免疫印迹(WB)检测耐药细胞诱导过程中EZH2蛋白的动态变化。3.应用慢病毒介导的shRNA(短发夹RNA)下调A2780和ES2细胞EZH2基因的表达水平(shEZH2 vs.shNC),实时定量PCR和WB检测EZH2的mRNA和蛋白水平,MTT比较调控EZH2前后细胞对顺铂的敏感性变化。4.应用慢病毒介导的EZH2过表达质粒,上调ES2细胞EZH2基因的表达水平(EZH2-08,EZH2-13和EZH2-NC),实时定量PCR和WB检测EZH2的mRNA和蛋白水平,MTT比较调控EZH2前后细胞对顺铂的敏感性变化。结果1、EZH2在所有纳入研究的卵巢癌组织中均有不同程度的表达,且耐药卵巢癌EZH2的表达显著高于化疗敏感组。2、对A2780和ES2周期性顺铂刺激(12个周期)获得A2780C12和ES2C12。克隆形成实验结果显示A2780C12和ES2C12对顺铂的耐药性显著高于亲本细胞,蛋白免疫印迹(WB)检测结果显示,在周期性顺铂刺激的过程中,EZH2的表达水平随着刺激周期数增加而逐渐升高。3、下调EZH2基因的表达水平,MTT结果显示A2780和ES2细胞对顺铂的敏感性增加。4、上调EZH2基因的表达水平,MTT结果显示ES2细胞对顺铂的敏感性降低。结论EZH2在化疗耐药的卵巢癌中高表达,且调控EZH2能够改变卵巢癌细胞对顺铂的敏感性改善耐药。第二部分EZH2影响卵巢癌细胞对铂药的摄入目的研究EZH2的表达水平对卵巢癌细胞内铂药蓄积的影响。方法1、顺铂处理shEZH2或shNC(阴性对照)转染的A2780和ES2细胞,石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)检测细胞内的铂含量以及顺铂摄入和排出的情况。2、siRNA(小干扰RNA)下调A2780和ES2细胞EZH2表达,建立不带荧光标记的EZH2下调细胞株,给予荧光铂BODIPY-Pt(绿色荧光BODIPY标记的顺铂类似物)处理,荧光显微镜检测细胞中荧光铂BODIPY-Pt的蓄积以及摄入情况。3、共聚焦荧光显微镜检测BODIPY-Pt和铜转运蛋白CTR1的共定位情况。结果1、GFAAS检测结果显示,与shNC组相比,shEZH2转染的A2780和ES2细胞中铂的蓄积显著增多,细胞对顺铂的蓄积增加,对顺铂的排出没有明显变化。2、与shNC组相比,shEZH2转染组的细胞BODIPY-Pt的荧光信号增强,动态监测显示细胞对BODIPY-Pt摄入增加。3、共聚焦显微镜观察细胞内BODIPY-Pt和CTR1的分布,细胞膜和细胞内的BODIPY-Pt均与CTR1具有较好的共定位一致性。结论EZH2主要通过减少铂药的摄入而影响细胞内铂药的蓄积。第三部分CTR1参与卵巢癌顺铂耐药目的研究顺铂转运体铜转运蛋白1(CTR1)的表达水平对铂药耐药的影响。方法1、Meta分析评价肿瘤组织中顺铂转运体CTR1、铜转运蛋白2(CTR2)、铜转运P型三磷酸腺苷酶1(ATP7A)和2(ATP7B)的表达水平与患者总生存期(OS)、无进展生存期(PFS/DFS)和化疗反应性(TR)的关系。在Pubmed、EMBASE、万方、GEO和TCGA数据库中进行文献和数据库检索。文献纳入标准:(1)研究实体瘤中CTR1、CTR2、ATP7A和ATP7B的表达水平和总生存期(OS)、无进展生存期(PFS/DFS)及化疗反应性(TR)相关性的临床实验;(2)回顾性和前瞻性临床研究;(3)直接或间接提供了足够估算生存预后及化疗反应性的信息。数据库纳入标准:(1)数据库中的患者全部或部分接受以铂为基础的化疗;(2)基因微阵列检测技术使用的Affymetrix平台;(3)单个数据集中符合以上条件的患者例数大于40例。文献排除标准:(1)临床实验中的患者未接受化疗,或所接受的化疗方案非以铂为基础的化疗方案;(2)临床研究的对象主要为CTR1,CTR2,ATP7A和ATP7B的单核苷酸多态性或DNA甲基化,而非其表达;(3)患者的结局并非生存/死亡或是否复发;(4)基本信息缺失。运用随机效应模型估算风险比(HR)评价OS和PFS,比值比(OR)评价TR。通过异质性分析和敏感性分析,评估Meta分析结果的稳健性。通过Eager’s test进行发表偏倚的分析。2、组织芯片-免疫组化法比较化疗敏感和化疗耐药卵巢癌患者肿瘤组织中CTR1蛋白的表达情况。3、WB检测顺铂导致的A2780和ES2细胞内CTR1的表达变化,比较顺铂敏感细胞A2780和顺铂耐药细胞ACP中顺铂介导的CTR1变化差异。结果1、Meta分析结果:(1)文献检索:经过纳入排除标准的筛选,最终纳入12篇文献,和8个数据库,共涉及2149例患者。(2)Meta分析:肿瘤组织中CTR1表达程度高的患者的OS,PFS/DFS和TR均比CTR1表达程度低的患者好。(3)亚组分析:“卵巢癌”、“肺癌”、“铂药化疗组”等亚组分析的结果均与总分析一致,且不受地域、数据来源和检测手段等因素的的影响。(4)未发现CTR2、ATP7A或ATP7B的表达情况和卵巢癌患者的OS、PFS/DFS或TR有显著相关性。(5)总分析和亚组分析均不存在发表偏倚,敏感性分析结果显示结果稳定性好。2、CTR1在所有纳入研究的卵巢癌组织中均有不同程度的表达,且化疗敏感组的CTR1的表达程度显著高于化疗耐药组。3、WB的结果显示,顺铂会导致A2780和ES2细胞中的CTR1的降解,其中顺铂耐药细胞ACP中CTR1的降解程度大于顺铂敏感细胞A2780中CTR1的降解程度。结论CTR1的表达程度及顺铂介导的CTR1降解程度与卵巢癌顺铂耐药相关。第四部分EZH2促进顺铂介导的CTR1蛋白酶体降解目的探索EZH2介导卵巢癌细胞铂药摄入减少的分子机制,研究细胞EZH2的表达水平对顺铂介导的CTR1降解的影响。方法1、慢病毒介导的shRNA下调A2780和ES2细胞EZH2基因的表达水平,WB检测调控EZH2前后细胞内H3K27Me3和CTR1蛋白的表达变化。2、慢病毒介导的shRNA下调A2780和ES2细胞EZH2基因的表达水平,或应用特异性EZH2抑制剂DZNEP和GSK126抑制EZH2的功能,WB验证调控EZH2表达、抑制EZH2功能的前后细胞内顺铂介导的CTR1降解程度的变化。3、慢病毒介导的shRNA下调A2780和ES2细胞EZH2基因的表达水平,CHX抑制蛋白合成,WB检测下调EZH2对CTR1蛋白半衰期的影响。4、慢病毒介导的shRNA下调A2780和ES2细胞EZH2基因的表达水平,CHX抑制蛋白合成,WB检测下调EZH2对顺铂介导的CTR1降解程度的影响。5、顺铂处理A2780和ES2细胞,MG132抑制蛋白酶体介导的蛋白降解,ShRNA干扰细胞EZH2的基因表达,免疫沉淀获取顺铂处理后的CTR1,WB检测EZH2下调前后CTR1的泛素化情况。6、蛋白质免疫沉淀-液相质谱检测调控细胞EZH2后所引起的CTR1相关蛋白谱的变化。结果1、下调A2780和ES2的EZH2基因表达水平,细胞内CTR1、CTR2、ATP7A和ATP7B的蛋白水平无明显变化。2、下调A2780和ES2的EZH2基因表达水平、特异性EZH2抑制剂DZNEP和GSK126抑制EZH2的功能,顺铂介导的CTR1降解程度减轻。3、CHX抑制蛋白合成,下调细胞EZH2的基因水平,CTR1的蛋白半衰期无明显变化。4、CHX抑制蛋白合成,下调细胞EZH2的基因水平,顺铂介导的CTR1降解获得一定程度的缓解。5、在A2780和ES2细胞中,顺铂刺激促进CTR1的泛素化,下调EZH2能有效减少顺铂介导的CTR1泛素化。6、液相质谱分析从ES2ShNC-CDDP(+)及ES2ShEZH2-CDDP(+)中免疫沉淀下来的CTR1及其相关蛋白,差异蛋白所涉及到的细胞生物学通路包括翻译、蛋白折叠、蛋白转运、细胞器定位和代谢。结论EZH2能够促进顺铂介导的CTR1泛素化及蛋白酶体降解。