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宫颈癌是妇产科最常见的恶性肿瘤,其发病率占女性生殖器官恶性肿瘤总数的一半以上,在女性癌症中仅次于乳腺癌居于第二位,死亡率为妇科肿瘤之首,是危害广大妇女身心健康的恶性肿瘤之一。过去人们认为宫颈癌属于化疗药物不敏感肿瘤仅在晚期及复发的患者中将化疗作为综合治疗的一部分。近年来国内外对化疗在宫颈癌中的应用进行了基础及临床方面的研究,取得了满意效果,提高了患者5年生存率,从而确定了化疗在宫颈癌治疗中的地位。但是化疗药物(如顺铂),因其不可避免的毒副作用限制了其使用剂量,同时也使部分患者不能耐受。这就迫切需要广大医学工作者寻找一些毒副作用小的药物来代替或协同目前的化疗药物达到较好的杀死肿瘤的目的。丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,TanⅡA)是从活血化淤中药丹参中提取出的脂溶性有效成分。近年来其抗肿瘤活性已有陆续报道,其对多种肿瘤细胞具有抑制增殖,诱导细胞凋亡或分化的作用。这使得其在抗肿瘤方面具备了良好的应用前景。顺铂(cisplatin,DDP)是一种DNA损伤药物,也是目前临床上宫颈癌化疗的首选药物。本课题首次将通过中药丹参酮ⅡA与顺铂联合作用于宫颈癌Hela细胞与两药单用效果的比较,研究二者联合的疗效是否优于单药以及二者在抗肿瘤方面有无协同作用,并对其作用机制加以初步探讨。旨在为宫颈癌的化疗提供更多的药物选择,同时也为中药丹参酮ⅡA在抗肿瘤中的应用提供理论基础。方法1.体外培养宫颈癌Hela细胞:常规方法复苏冻存的Hela细胞,接种于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液的瓶中,置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内。将实验分为四组:阴性对照组(Control)中加入含0.1%DMSO;丹参酮ⅡA组(TanⅡA)中加入2ug/ml丹参酮ⅡA;顺铂组(DDP)中加入5ug/ml顺铂;两药联合组(Combination)中加入2ug/ml丹参酮ⅡA与5ug/ml顺铂,分别培养72h。2.用MTT比色法测定细胞生长抑制情况:测定各组吸光度OD值,并计算各组Hela细胞生长抑制率。3.HE染色法观察各组细胞的形态学变化。4.流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测并计算各组细胞凋亡率。5.Western Blot测定各组细胞中凋亡相关蛋白P53、Bcl-2及Bax的表达水平。结果1.TanⅡA组、DDP组及两药联合组细胞增殖均被抑制;TanⅡA组、DDP组及两药联合组根据公式:抑制率(IR)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%,计算其抑制率分别为40.01%、48.18%和78.19%;两药联合组细胞增殖抑制率明显高于两单药组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。根据公式计算丹参酮ⅡA与顺铂联合作用时的相互作用系数(CDI)值为CDI＜1,故二者具有协同作用。2.HE染色发现TanⅡA组、DDP组及两药联合组均可见凋亡细胞的典型形态学改变,而在对照组无细胞凋亡的形态学改变。3.流式细胞仪检测TanⅡA组、DDP组及两药联合组细胞均可见亚二倍体凋亡峰,对照组无明显亚二倍体凋亡峰,TanⅡA组、DDP组及两药联合组凋亡率分别为11.1%、11.4%和17.6%。两药联合组与两单药组凋亡率之间差异有统计学意义(P＜0.05)。4.Western Blot测定P53蛋白在四组中均有表达,且两药联合组中表达水平高于两单药组;Bcl-2蛋白在各组中均有表达,但表达水平变化不明显;Bax蛋白在对照组中几乎不表达,而在TanⅡA组、DDP组及两药联合组中均有表达,且两药联合组中表达水平高于两单药组。结论1.丹参酮ⅡA与顺铂均可在体外抑制宫颈癌Hela细胞的增殖,丹参酮ⅡA与顺铂联合作用时对Hela细胞的增殖抑制作用更显著,二者具有协同作用。2.丹参酮ⅡA与顺铂均可在体外诱导宫颈癌Hela细胞凋亡,二者联合对宫颈癌Hela细胞的凋亡诱导作用更明显。3.丹参酮ⅡA、顺铂及二者联合在体外诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的机制之一可能是通过恢复野生型P53的功能、上调促凋亡基因Bax的表达实现的。两药联合组细胞凋亡率高于两单药组可能与联合组中野生型P53及Bax蛋白的表达高于两单药组有关。4.丹参酮ⅡA、顺铂及二者联合在体外抗肿瘤的作用机制之一可能与抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的凋亡有关。