基于SELEX法筛选吊白块的核酸适配体及其应用

来源 :昆明理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yyaizy
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食品添加剂分为两类,一类是国家允许添加但对添加量有明确要求的;另一类是国家命令禁止不允许添加到食品中的。市面上有许多不法商贩受利益驱使,违法使用食品添加剂,给食品安全带来极大的安全隐患。为规范食品添加剂的合理使用,在市场流通环节急需一种能够快速、准确检测食品添加剂的策略。吊白块,化学名称为甲醛次硫酸氢钠或次硫酸氢钠甲醛。它是一种强致癌物质,对人体的肝、肺和肾脏都有极大损伤,成人经口摄入纯吊白块10克就会中毒死亡。在国家标准《食品添加剂使用卫生标准》中,吊白块严禁在食品加工中添加使用。但不法分子仍在米粉、豆皮、豆腐、鱼翅中违法添加吊白块使食品增白。因此,开发一种快速、稳定、灵敏、便捷的检测食品中的吊白块添加情况是一个亟待解决的科学问题。为解决该难题,本文首先进行了基于SELEX法的特异性识别吊白块核酸适配体的筛选研究。将吊白块与亲和填料Epoxy-activated sepharose 6B进行偶联作为靶分子,与体外合成的随机文库进行孵育,利用钾离子浓度梯度递增来筛选吊白块的核酸适配体。经过10轮SELEX筛选,对最终产物进行纯化、克隆、测序。对得到的一系列核酸适配体进行二级结构分析,其中茎环和G-四链体结构为主要的结构。并进一步通过圆二色谱法验证了钾离子不会影响核酸适配体的结构。此外,本文还建立了一种新的酶联寡核苷酸法——ELONA(Enzyme Linked Oligonucleotide Assay),验证了吊白块核酸适配体对靶标的高亲和力和强特异性,确定适配体Sfs-A09、Sfs-B09、Sfs-E07,其解离常数分别为39.81±11.78 nM,47.89± 12.73 nM,61.12±16.36nM。这说明三种核酸适配体都具有很好的识别吊白块的能力。本文进一步将吊白块稀释四个浓度(1 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL、10ng/mL)加入豆腐样品中进行模拟实验,吊白块的回收率在80.14%~101.10%之间,且具有很好的线性关系。证明将吊白块的三条核酸适配体运用于实际产品检测的可能性。在此基础上,本文建立了一种基于双核酸适配体检测吊白块的夹心法。探究此检测方法的可靠性,分别进行了特异性实验和灵敏度实验。双核酸适配体夹心法检测吊白块毒素,具有较高的特异性;在相同条件下,双核酸适配体检测灵敏度明显高于一条核酸适配体检测。基于以上结论,本文探究了基于双核酸适配体夹心法吊白块在实际样品中的检测。本方法检测吊白块的线性范围为1~10 ng/mL,检测限为0.1 ng/mL(3S/N)。本文还对吊白块在实际样品中的模拟添加进行相关研究,基于ELONA夹心法建立了一种快速、准确、方便、直接的检测方法,可用于实际样品的检测。同时也证实了三条核酸适配体Sfs-A09、Sfs-B09和Sfs-E07具有研发吊白块检测试剂盒的潜能。
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