论文部分内容阅读
本论文是国家体育总局反兴奋剂中心青年课题(2014QK002)——《非甾体类芳香化酶抑制剂的代谢及其影响内源性甾体激素排放规律的研究》的部分内容。目的和意义：芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors, AIs)作为芳香化酶选择性抑制剂,可以特异性地抑制芳香化酶的活性,降低雌激素的水平,增加血睾酮的浓度。因此,2001年国际奥林匹克委员会(IOC)将其列入禁用清单,禁止男性运动员使用。随后世界反兴奋剂机构(WADA)于2005年规定该类药物在女性运动员中也禁止使用。氨鲁米特、来曲唑和阿那曲唑为市场上最常见的三种非甾体类芳香化酶抑制剂。目前兴奋剂检测的方法主要包括直接法和间接法。直接法是通过检测运动员尿液中禁用药物的原型或代谢物来判断运动员是否服用该种药物,而间接法则是利用监控运动员自身生理生化指标的变化幅度来判定运动员是否有兴奋剂违规行为。本研究旨在用高灵敏度仪器(UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap Quotation)寻找新代谢物,并在完善直接法检测的同时研究探寻非甾体类芳香化酶抑制剂影响人体内源性甾体激素的变化规律,将高特异性、高灵敏度的生物指标用于运动员生物护照(ABP)分析。研究方法：本研究在获得了国家体育总局反兴奋剂中心伦理委员会批准后,组织人体受试。在北京中医药大学和北京体育大学共组织招募志愿者41名(其中：男性21名,女性：20名),随机分为A、B、C三组,其中A组12人(6名男性,6名女性),B组14人(8名男性,6名女性),C组15人(7名男性,8名女性),分别口服氨鲁米特、来曲唑和阿那曲唑三种药物。A组口服氨鲁米特(250 mg×2/天),连续服用3天,B、C两组分别口服来曲唑(2.5 mg×1/天)和阿那曲唑(1.0 mg×1/天),连续服用5天。服药前,收取7天全部尿样作为空白对照,服药期间及停药后的3天留取全部尿样,停药后第四天开始至第28天收取晨尿。代谢物分析的尿样前处理方法采用醋酸铅沉淀后直接进样液质联用仪进行分析,使用代谢物筛查软件Mass Frontier 7.0 SR寻找代谢产物,根据软件分析结果和二级谱图的分析推导代谢物结构。内源性甾体激素定量的尿样前处理采用酶水解后,乙醚提取、吹干、衍生化进样气质联用仪进行分析。对于气质联用仪定量后得到的数据,首先采用探索性数据分析对人体的8个内源性甾体激素浓度指标逐一进行直观的图像分析,从图像中查看数据的规律,再运用假设检验中的wilcoxon秩和检验找出与服药前无显著差别的数据点,由此得到该指标判定服药的有效窗口期。统计分析所使用的统计分析软件为Rstudio Version 0.99.467。统计指标包括：睾酮(T)、表睾酮(ET)、雄酮(AN)、本胆烷醇酮(ETIO)、5α-雄烷二醇(5α-diol)、5β-雄烷二醇(5β-diol)、去氢表雄酮(DHEA)和雌酮(Estrone)以及它们的比值。研究成果：(a)本研究中发现主要代谢物共计33个。包括氨鲁米特代谢物24个,来曲唑代谢物4个和阿那曲唑代谢物5个。其中24个代谢物未在文献中报道,为首次在人尿中发现的代谢产物。(b)服药后雄激素(T, ET, AN, ETIO,5α-diol,5β-diol和DHEA)浓度升高,雌激素(Estrone)浓度下降,停药后逐渐恢复正常。该趋势在女性志愿者中变化不如在男性志愿者中显著。(c)比值指标分析中,先使用空白尿样的数值计算出95%和99%的分位点,再分别使用该分位点对服药后的阳性尿样进行判定并比较判出率,结果如下：在95%分位点时,新指标AN/Estrone判出率为57.86%,ETIO/Estrone判出率为58.25%,T/Estrone判出率为33.86%；在99%分位点时AN/Estrone判出率为42.14%,ETIO/Estrone判出率为45.30%,T/Estrone判出率为24.79%。WADA技术文件中所包含指标的判出率：在95%分位点时,T/ET判出率为5.21%,5α-diol/5β-diol判出率为5.49%,AN/T判出率为10.34%,AN/ETIO判出率为4.90%,5α-diol/ET判出率为3.78%。在99%分位点时,T/ET判出率为3.05%,5α-diol/5β-diol判出率为0.30%,AN/T判出率为5.86%, AN/ETIO判出率为1.37%,5α-diol/ET判出率为1.10%。新指标的判出率明显高于WADA旨标的判出率。(d)使用运动员生物护照(ABP)的分析思路,建立三个新指标的加权移动平均控制图(EWMA)模型,并将该模型用于单个志愿者指标波动分析。结果显示,服药后这三个指标波动明显,可以用于判定可疑样品。(e)对这三个新指标进行实验验证：1名男性志愿者单次口服甾体类芳香化酶抑制剂—依西美坦(25mg),服药后留取3天全部尿样,第4天至第15天留取晨尿。验证实验表明使用依西美坦后指标T/Estrone出现大幅度波动,直到第10天以后才恢复正常,而使用现有的检测依西美坦代谢物的方法进行检测,窗口期仅为25.5小时。由此可见,该指标同样适用于监控甾体类芳香化酶抑制剂的滥用。结论及意义：通过对非甾体类芳香化酶抑制剂的代谢及其对人体内源性甾体激素排放规律的研究,发现了33个代谢产物(其中24个为本研究中首次发现)。整理、归纳、计算出适用于判断芳香化酶抑制剂滥用的新指标(AN/Estrone、ETIO/Estrone和T/Estrone);实验结果表明,该指标特异性强、灵敏度高,有效延长了对该类药物的检测窗口期,同时也对运动员生物护照项目的推动提供了可靠依据和有益补充。