研究背景在天然免疫中发挥重要作用的KIR基因家族,包含14个功能性基因和2个假基因。KIR基因不仅存在等位基因水平的多态性,而且还存在单倍型组成的差异。鉴定KIR等位基因具有功能性及临床意义。迄今国际上只有鉴定KIR基因有无的低分辨水平试剂盒,尚无高分辨水平KIR基因测序分型商品化试剂盒。文献业已报道的KIR测序分型方法,有的仅针对部分外显子进行测序分型;有的虽涵盖了全部外显子,但由于退火温度、PCR扩增片段长度及扩增时间的不同,难以实现高通量化同步扩增。技术上的瓶颈导致了 KIR等位基因多态性数据的缺乏:系统全面报道14个功能性KIR基因高分辨水平多态性的研究论文,中国汉族人群尚属空白,国际上仅见于非洲、高加索、日本及毛利人群。研究对象根据知情同意原则,采集306例南方汉族志愿献血者无关个体的血样。研究方法本文利用在国家自然科学基金(81373158)资助下建立的14个功能性KIR基因同步测序分型专利技术,对306例南方汉族献血者样本进行了检测:(1)采用3～4对KIR基因特异性PCR引物对每个功能性KIR基因的全部编码区进行特异性PCR扩增,扩增产物电泳结果与KIR SSP商品化试剂盒检测结果相比较。阳性特异性扩增产物纯化后进行双向测序反应,ABI3730测序仪电泳检测。(2)针对测序分型中的模棱两可等位基因组合,采用“组特异性PCR扩增—纯化—再测序”方法鉴定确切的基因型。(3)测序分型中出现无完全匹配结果的样本,重新采集新鲜血样,通过分子克隆测序鉴定可能的KIR新等位基因,其编码序列分别提交GenBank和WHOIPD-KIR数据库。(4)统计检出的KIR等位基因、精细水平KIR基因组合型及其检出率,进行单核苷酸水平多态性及进化分析。研究结果(1)本文获得了 44500余条序列,共检出116种等位基因,其中46种为WHO正式命名的新等位基因。结构基因2DL4、3DL2、3DL3检出的等位基因分别为11、18、19种,多态性丰富;而激活型KIR等位基因多态性则相对保守,如2DS5检出1种、2DS2和2DS3均检出2种、2DS1检出3种。(2)306例样本中检出高分辨水平KIR基因组合型258种,其中AA、AB及BB型高分辨水平KIR基因组合型分别为124种、119种、15种。(3)编码胞外结构域的第3～5外显子和编码胞浆尾的第7～9外显子的平均核苷酸突变率(π)远高于编码引导肽的第1～2外显子和编码穿膜区的第6外显子。(4)不同的KIR基因编码区的γ(dn/ds)值各不相同,说明其突变在进化过程中受到的自然选择作用各不一样。研究结论和意义本文创建了 KIR模棱两可等位基因组合的鉴定方法。筛选和发现了 46个WHO认可的KIR新等位基因,其序列均已提交WHO IPD-KIR数据库供全球同行使用,有助于提高南方汉族人群KIR基因精细分型的准确率和涵盖率。同时首次获得了完整的南方汉族人群的KIR等位基因、精细水平KIR基因组合型、单核苷酸多态性及进化树分析等多态性数据,可为移植、疾病关联研究、KIR测序分型试剂盒的研发以及人类进化提供基础资料和重要参考。