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病毒与宿主细胞蛋白的相互作用一直以来是病毒学界的研究热点。例如在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的研究中,科研工作者通过建立HCV的细胞模型(亚基因组复制子模型和全长基因组复制子模型)来研究细胞与病毒的相互作用,研究发现了两个十分重要的抗病毒药物设计靶点即NS3丝氨酸蛋白酶以及NS5BRNA依赖性RNA聚合酶。
但所有类似的研究都需要基于一定的方法和策略。在SV40与Vero细胞的研究中使用诸如MβCD、nocodazole等药物并结合细胞器染色技术来研究病毒与细胞相互作用机理。而近年来使用化学发光试剂标记病毒衣壳蛋白或假病毒粒子(virus-like particles,VLPs)以研究病毒与细胞相互作用则是很有应用前景的新方法。
本研究基于我们实验室研究平台并结合化学领域中新合成的发光纳米材料(例如量子点,“光开关”等)的优势,研究两种无囊膜的病毒即兔出血热病毒(rabbithemorrhagic disease virus,RHDV)和人类博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)主要衣壳蛋白在昆虫细胞中形成的VLPs与Sf9(Spodoptera frugiperda)、RK13(rabbit kidney13)以及猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)与猪精细胞(porcine testis,PT)的相互作用,进而揭示病毒在细胞中的运动途径,阐明病毒与宿主细胞的相互作用机制,并根据这些数据来探索建立一个病毒与细胞相互作用的一般研究方法。其完成的工作包括以下几个方面:
1.表达并纯化出兔出血热病毒RHDV衣壳蛋白VP60;
1)将RHDV衣壳蛋白基因VP60插入到pMAL-c2X载体,获得重组质粒pMAL-VP60并在大肠杆菌DH5α中表达VP60蛋白,经SDS-PAGE及Western Blot检测后,扩大培养并利用Amylose亲和层析柱纯化VP60蛋白。并将纯化出的VP60蛋白尝试在体外控制条件下使其自组装成VLPs。
2)使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在High-Five cell(Hi-5)昆虫细胞中表达VP60蛋白。重组Bacmid感染Sf9并使用MOI为5~10的病毒再感染Hi-5细胞以表达VP60-VLPs,然后使用蔗糖及CsCl梯度离心获得较纯净的VLPs,电镜观察。
2.表达并纯化HBoV衣壳蛋白VP2;
1)将HBoV衣壳蛋白基因VP2插入到PET-28(a)载体,获得重组质粒PET-28(a)-VP2并在大肠杆菌BL21中表达VP2蛋白,操作方法同上。纯化获得的VP2蛋白主要用于制备多克隆抗体。
2)使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Hi-5真核细胞中表达HBoV假病毒衣壳VP2-VLPs蛋白,纯化方案同上并电镜观察。
3.量子点(Quantum Dots,QDs)标记VP60-VLPs后与Sf9及RK13相互作用研究方法的初步探索。