金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人类主要的致病菌之一，通常在社区正常人体内也有定居，在住院病人则常常引起严重的感染。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistance Staphylococcus aureus，MRSA)，单从命名来看，会给人以误导，因为甲氧西林目前已经不再用于金葡菌的临床治疗，其意义等同于多重耐药的金黄色葡萄球菌。而随着由MRSA引起的感染逐渐增多，治疗起来也变得越来越困难。粘附是指细菌通过其表面结构或大分子物质定居在细胞、人工材料等各种固体物质表面的过程或能力。近年来，大量研究结果证明， 粘附是很多细菌致病的先决条件，是细菌与宿主相互作用的第一步，病原菌粘附于易感细胞、粘膜等之上后方能发挥其正常生理作用，从而引起感染致病。粘附是细菌致病的第一步，对细胞以及基质的粘附促进细菌定植以及感染，对生物材料的粘附促进细菌生物膜的形成。细菌粘附是个复杂的过程，众多机制参与其中，涉及了从单体蛋白质到极为复杂的大分子蛋白质，不同细菌的粘附机制不尽相同。粘附起始靠的是布朗运动、范德华力、静电吸引力等物理力作用，不稳定、可逆的附于表面，液体的冲击等即可使其移动、脱落。此过程非特异性，连接较松且易于分离；其后，细菌通过表面的菌毛、鞭毛等细胞器以及的特定粘附素蛋白(adhesin)与宿主细胞上的相应受体进行识别并相互作用，使其紧紧地附着于宿主细胞之上并进一步发挥其生理功能，该过程为具有选择性和特异性，粘附后稳定不易分离。产生较为牢固的受体一配体样特异性结合，此为粘附的主要过程。粘附成功以后，方开始其进一步损伤作用。所以，粘附力大小与致病力强弱直接相关。对金黄色葡萄球菌来说，介导粘附的主要为菌体表面的蛋白成分。包括纤维连结蛋白结合蛋白(FnBP)、胶原粘附素(CNA)、凝集因子(ClfA)、胞外基质结合蛋白(Emp)等。能够与宿主细胞、基质成分中的相应受体结合，促进细菌定植、长期存在。因此，作为MRSA的重要毒力因子之一，粘附力在其致病过程中占据重要地位，从1981年以后，人们逐渐注意到了在抗菌药物使用后细菌粘附能力发生的变化，并作了一系列研究，已有的研究结果表明，亚抑菌浓度的抗菌药物能够改变MRSA的粘附力，从而增强或减弱其致病力。对MRSA在抗菌药物作用下粘附力改变的研究，将进一步揭示院内MRSA感染的机制，为控制院内MRSA感染提供新的策略，同样也有助于研发新的抗感染生物材料。 材料和方法: 1、实验菌株的准备 通过纤维支气管镜吸取呼吸内科ICU内MRSA肺炎患者下呼吸道分泌物，经细菌培养及分离，利用传统生化鉴定结合药敏结果确定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 2、抗菌药物对MRSA的诱导 准备5种临床常用抗菌药物，分别为头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、万古霉素、阿奇霉素。根据美国国家临床实验标准委员会(NCCLS)抗菌药物敏感性试验操作标准，以液体对倍稀释法测其分别对应于5种抗菌药物的MIC,测定时以标准株(ATCC 29213)作为参照，以保证结果的准确性。继而配制含有1/4MIC、1/16MIC抗菌药物的MH肉汤，加入菌液使其细菌浓度约为5×10<5>CFU，37℃ 5﹪CO<,2>下孵育20小时，5000rpm,5min离心收集细菌，PBS洗涤2次，加入PBS使其重新悬浮并调整浓度至约1×10<8>CFU/ml(OD=0.2，625nm)； 3、上皮细胞的培养 将人宫颈癌上皮细胞株(Hela细胞)转至50cm<2>培养瓶，加3ml含10﹪胎牛血清、2﹪HEPES的RPMl 1640完全培养液，放入37℃，95﹪湿度，5﹪CO<,2>细胞培养箱，2～4天更换一次新鲜培养液，待细胞贴壁生长至培养瓶面积的80～90﹪传代，约5～7天传代一次。取用细胞时，吸出培养液，以D-HANKS液洗涤2次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，倒置显微镜下实时观察细胞消化情况，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明细胞消化适度。弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液。用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。将细胞悬液吸入15ml离心管中。以1000rpm，8min离心。弃上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。吹打均匀后，以血细胞计数板进行计数，并调整细胞浓度为3×10<5>/mL备用； 4、粘附实验 4.1非特异性粘附实验将细菌悬液浓度调整至10<5>CFU/L，取菌液约0.2ml，均匀涂于玻片约1.0×1.0 cm<2>区域内，放入培养箱，37℃，5﹪CO<,2>4小时；继而以无菌水漂洗玻片，去除未粘附的细菌，酒精灯干燥、固定残留细菌，瑞氏法染色，置光学显微镜下观察每高倍视野(×1000)残留细菌数量，每张玻片计数12个视野； 4.2特异性粘附能力 (1)以酶消化法制备Hela细胞悬液，并调整细胞浓度至3×10<5>/ml； (2)将经过抗菌药物诱导的含菌肉汤离心，收集细菌，以PBS洗涤1次，再次加入PBS使其重新悬浮，根据比浊法及分光光度仪调整细菌浓度至约为1×10<8>CFU/ml； (3)将制备好的细菌及细胞悬液按照1：1混合，置于37℃，5﹪CO<,2>培养箱中1小时后取出，1000rpm，5min离心收集细胞，并以PBS洗涤3次，以去除未粘附之细菌，尽可能倒尽上清液，再次加入PBS液40杩重新悬浮细胞，并于盖玻片上涂片，自然干燥后行瑞氏．吉姆萨染色，光学显微镜下观察，计数不同抗菌药物浓度下生长的细菌在细胞上的粘附比率。 5、统计学处理： 数据以均数±标准差(X±SD)表示，应用SAS 8.01统计分析软件包进行进行t检验及方差分析。P值<0.05被认为是有统计学意义的。 结果: 头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星能够增强MRSA的粘附力。万古霉素、阿奇霉素能够降低MRSA的粘附力。讨论与结论粘附是细菌定植、致病的先决条件，与细菌毒素一起决定了细菌的致病力。MRSA粘附力的增强或减弱是其表面蛋白表达增加或减少的结果。这些蛋白包括：纤维连接蛋白结合蛋白(Fnbp)、胶原粘附素(CNA)、凝集因子(CIfA)等。粘附的主要过程就是细菌表面的粘附分子与宿主细胞或细胞外基质上的受体相互识别、结合的过程，抗菌药物在转录、翻译等不同水平作用于这一过程而影响MRSA的粘附力。由于存在结构上的差异，不同类的抗菌药物影响机制则不尽相同。本试验结果提示：头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星等抗菌药物显示出能够增加MRSA粘附力，而阿奇霉素、万古霉素则起抑制粘附作用。目前，在临床上，头孢他啶、亚胺培南等β-内酰胺类广谱抗菌药物的使用日益广泛，而MRSA由于多重耐药，在体内，这些药物难以达到有效抑菌、杀菌浓度，因此不能够清除定居于上呼吸道MRSA，而头孢他啶、亚胺培南的使用反而使其粘附力增加，易于在下呼吸道定植并进一步致病。这与我们临床观察结果相一致。β-内酰胺类广谱抗菌药物的广泛使用有可能是造成院内MRSA感染率增加的原因之一。环丙沙星的使用同样能够增强MRSA的粘附力，进而增加院内MRSA肺炎的机会。经过环丙沙星诱导后的MRSA，FnbpB的表达增加是其粘附力增强的原因。不同的临床统计结果显示，环丙沙星的使用容易导致院内MRSA肺炎的发生。 万古霉素能够降低MRSA粘附力的作用，从而降低致病力。然而，尽管万古霉素表现出有效的抗MRSA活性(MIC=1.0mg/L)，甚至在抑菌浓度以下也能够减弱其致病力，但为了减少耐药的发生，应尽可能减少万古霉素的使用，以维持其目前尚有效的抗MRSA活性。本次实验结果提示亚抑菌浓度的阿奇霉素能够减弱MRSA的粘附力，另有许多研究结果提示此类药物包括红霉素等能够明显减少MRSA外毒素的表达，抗菌机制与其相同的红霉素、克林霉素也可能具有同样作用。在MRSA所致的感染中，外毒素起着重要作用，因此临床上在治疗MRSA感染时，若中毒症状较重，可考虑使用阿奇霉素、克林霉素等药物以拮抗毒素作用，也许在今后，抗毒素治疗有可能成为MRSA感染的重要治疗措施。 本试验揭示了各类抗菌药物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌粘附能力的不同影响，结果提示：头孢他啶、亚胺培南等β-内酰胺类药物能够增加MRSA的粘附能力，进而增强其致病力，因此，它们的广泛使用在一定程度上增加了MRSA感染的机会，可能是引起院内MRSA肺炎的重要原因。而环丙沙星的使用同样显示出增强粘附力的作用，也能够增加院内MRSA感染的发生机会。万古霉素及阿奇霉素，则对MRSA粘附力存在抑制作用：万古霉素的使用将不可避免增加耐药性产生的机会；阿奇霉素除了能够抑制MRSA的粘附力以外，还有可能减少其外毒素的产生，与其作用机制相同的红霉素、克林霉素亦可能具有相似的作用。这对于临床工作者在抗菌药物的选用方面提供参考意义。合理的使用抗菌药物，有助于控制院内MRSA感染率，减少耐药菌株的产生，达到最佳的治疗效果。 因此，在临床实践当中，应进一步规范合理地使用抗菌药物，尤其是β-内酰胺类广谱抗菌药物及喹诺酮类药物。临床上不合理使用β-内酰胺类广谱抗菌药物以及喹诺酮类药物可能是诱发院内MRSA感染的原因之一。