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角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor)是成纤维细胞生长因子家族的一员,它通过与受体(KGFR)的结合,特异性地刺激上皮细胞的增殖,对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用,能减少放化疗所带来的副作用。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF(KGF<,des1-23>)具有更高的稳定性和活性。
为了制备高纯度和高活性的人截短型KGF,本研究采用基因重组技术,选择单一、融合和分泌三种表达方式构建了多个不同的原核表达菌株,并构建了巴斯德毕赤酵母胞外和胞内表达两种菌株,分析了不同菌株的表达情况。本研究还摸索了表达菌株的发酵工艺、探索了不同形式表达产物(包涵体、可溶蛋白和融合蛋白)的纯化工艺。本研究还通过蛋白N端测序和免疫印迹对目标蛋白进行了鉴定。最后,采用上皮细胞和间质细胞进行了促细胞增殖活性的检测。
最终,本研究得到了两个原核表达菌株,初步建立了纯化工艺并获得少量的目标产物;蛋白N端测序和免疫印迹验证结果表明,表达产物与理论设计的人KGF<,des1-23>相符;细胞实验显示,本研究获得的表达产物对上皮细胞有明显的促增殖活性。
另外,本研究对KGF<,des1-23>蛋白的突变体进行了同源模建,通过分析其突变前后的原子位移均方根偏差构象变化,找出可能的重要位点,并通过基因重组的方法进行了初步的分析验证。