【摘 要】
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目的糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是围术期神经认知障碍（Perioperative Neurocognitive Disorders,PND）的独立危险因素。本研究通过构建糖尿病大鼠胫骨骨折内固定术PND模型,探讨m TOR-自噬通路在DM加重PND中的作用机制。方法1.糖尿病及PND大鼠模型的建立本实验通过腹腔注射链脲佐菌素STZ 50mg/kg建立糖尿病大鼠模型;2%异氟烷
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目的糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是围术期神经认知障碍（Perioperative Neurocognitive Disorders,PND）的独立危险因素。本研究通过构建糖尿病大鼠胫骨骨折内固定术PND模型,探讨m TOR-自噬通路在DM加重PND中的作用机制。方法1.糖尿病及PND大鼠模型的建立本实验通过腹腔注射链脲佐菌素STZ 50mg/kg建立糖尿病大鼠模型;2%异氟烷麻醉下完成左胫骨骨折内固定术建立PND模型。2.mTOR-自噬通路在糖尿病加重PND中的作用及机制1)首先为了明确m TOR-自噬通路在糖尿病大鼠围术期神经认知障碍中的变化,我们将6-8周龄Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为4组（n=45）:正常对照组（C组）,糖尿病组（DM组）,手术组（PND组）,DM+PND组。2)紧接着,为了进一步明确糖尿病是否通过激活m TOR抑制自噬而加重围术期神经认知障碍,我们应用m TOR特异性抑制剂雷帕霉素进行反向验证。SD大鼠随机分为8组（n=45）:溶剂组（DMSO组）,DM组,DM+溶剂组（DM+DMSO组）,DM+m TOR抑制剂组（DM+Rapa组）,PND+DMSO组,PND+Rapa组,DM+PND+DMSO组以及DM+PND+Rapa组。术前连续3天腹腔注射雷帕霉素（0.5mg/kg*天）,最后一次注射后2小时开始手术。术后3天,7天和14天检测以下指标变化:1)应用Morris水迷宫评估大鼠学习和记忆水平;2)应用Western blot检测cleaved caspase3,Bax和Bcl-2的表达变化,以评估凋亡水平;3)应用免疫组化结合Western blot检测Aβ和p-tau（Ser 396）的表达变化,评估神经毒性蛋白的沉积水平;4)应用Western blot检测Beclin1和LC3的表达变化,评估自噬水平;5)应用免疫组化及Western blot检测p-m TOR（Ser 2448）的表达变化,了解m TOR信号通路激活状态。通过以上正反两方面验证,明确m TOR-自噬通路在糖尿病加重围术期神经认知障碍中的作用机制。结果1.成功建立糖尿病及PND大鼠模型1)我们成功建立DM大鼠模型:STZ注射后第3天至术后14天大鼠均出现血糖显著增高,体重显著减轻。2)成功建立PND大鼠模型:术后3和和7天,接受手术的大鼠出现逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少及穿越目标象限时间缩短等症状,并于术后14天恢复至术前水平。2.DM加重围术期神经认知障碍与m TOR-自噬通路有关1)DM明显加重PND大鼠的学习和记忆功能障碍,表现为:逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,在目标象限停留时间缩短;2)DM加重PND大鼠海马Aβ沉积和tau蛋白磷酸化,表明接受全麻手术的DM大鼠海马中神经毒性蛋白沉积增加;3)DM激活PND大鼠m TOR通路抑制自噬,表现为:Beclin-1、LC3 II/I表达减少,p-m TOR（Ser 2448）表达增加。3.DM通过m TOR-自噬通路加重PND1)雷帕霉素不影响大鼠血糖代谢:雷帕霉素注射后,大鼠血糖和体重与溶剂组相比没有统计学差异;2)雷帕霉素抑制异常激活的m TOR信号通路增强自噬:表现为Beclin-1、LC3表达增加而p-m TOR（Ser 2448）表达水平减少;3)雷帕霉素显著减少Aβ和p-tau（Ser 396）的表达,表明雷帕霉素腹腔注射能减轻接受全麻手术的DM大鼠海马神经毒性蛋白的沉积;4)雷帕霉素减轻由糖尿病和手术引起的神经元凋亡:表现为Bcl-2表达增加而Bax和caspase3的表达降低;5)雷帕霉素减轻糖尿病和手术引起的学习和记忆功能障碍:表现为逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加,在目标象限停留时间增加。结论糖尿病通过激活m TOR信号通路抑制自噬进而促进Aβ沉积和tau磷酸化,最终加剧了海马神经元凋亡和围术期神经认知障碍。
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