应用DNA-SIP研究甘蔗//大豆间作系统参与氮素循环核心功能微生物多样性

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甘蔗是我国主要的糖料作物,实践生产中普遍存在超量施肥、偏施氮肥和单一种植等问题,甘蔗//大豆间作不仅能提高土地利用效率,还能强化蔗田生态系统服务功能,减少化学氮肥的投入。本研究在9年田间定位试验的基础上研究了减量施氮和间作大豆对作物产量、农艺形状、土地生产力及土壤肥力的影响,并在盆栽试验中应用同位素原位标记、稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)、实时荧光定量PCR(qPCR)和高通量测序等技术,从作物间氮素转移、氮循环关键功能基因和氮循环核心功能微生物的角度探讨了甘蔗//大豆间作系统中氮素迁移转化机制。主要结果如下:1.连续9年田间定位试验研究结果表明,间作大豆可以提高土地生产力和土地利用效率,减量施氮(300 kg·hm-2)下甘蔗//大豆1:2间作模式能够满足甘蔗生长对氮素需求;同茬间作甘蔗通过对土壤氮素竞争性吸收,能够解除或减轻“氮阻遏”效应,促进大豆固氮;且随着种植年限的增加,间作模式能有效缓解作物连作障碍。综合多指标分析得出,减量施氮水平下的甘蔗//大豆1:2间作种植模式能够有效利用土地资源,提高系统生产力,保持作物产量稳定,节约生产成本、增加经济收益,是一种结构优化合理的农艺种植措施,值得实践推广。2.采用(15NH4)2SO4溶液进行大豆叶脉注射标记后检测大豆和甘蔗各部位以及土壤中15N同位素丰度,标记单作处理和间作处理的大豆地上部、大豆根和大豆根围土样品均检测到较高的15N丰度,且都显著高于对照组,因此证明15N成功标记到作物、土壤及土壤微生物,并被其同化代谢。利用qPCR技术检测6个氮素循环功能基因在DNA-SIP超高速离心后不同浮力密度离心液中的基因拷贝数,通过对氮素循环功能基因相对丰度作图分析,nifH和amoA基因在甘蔗//大豆间作和大豆单作种植模式中15N标记组与对照组基因丰度峰发生偏移,chiA基因丰度峰值仅在大豆单作种植模式下存在偏移,而nirS、nirK、nosZ等3个基因的丰度峰值在两种种植模式下均不发生偏移,因此,nifH和amoA基因可作为指示基因,能够有效鉴定甘蔗//大豆间作系统中DNA-SIP技术15N-DNA位置。3.利用qPCR方法检测了盆栽条件下甘蔗//大豆间作系统中调控土壤氮循环关键基因nifH、chiA、amoA、nirK、nirS和nosZ的丰度,结果表明间作大豆根际土壤中功能基因nifH基因和amoA基因相对丰度均显著高于单作大豆处理,说明甘蔗//大豆间作能够有效促进固氮和硝化等氮循环过程。4.盆栽大豆根际土壤微生物测序表明,直接参与甘蔗//大豆间作系统土壤氮循环的微生物中细菌丰度显著高于古菌,相对于古菌,细菌是土壤氮循环的主要驱动者;直接参与土壤氮素循环的微生物优势门为Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Planctomycetes、Gemmatimonadetes、Nitrospirae、Armatimonadetes等8个;直接参与土壤氮素循环的微生物优势属为Burkholderia、Candidatus Koribacter、Nitrospira、Ralstonia、Rhodoplanes、Candidatus Solibacter、Pseudoxanthomonas等7个属。相同种植模式中直接参与氮素循环微生物群落的独有OTU数量均显著高于未参与群落,聚类分析发现,所有被15N标记的微生物物种聚为一类,所有的未标记的物种聚为另一类,因此说明直接参与甘蔗//大豆间作系统土壤氮素循环与未参与的微生物物种之间有明显差异。5.冗余分析(RDA)表明,土壤NO3--N、AN、TN的含量是影响直接参与甘蔗//大豆间作系统土壤氮循环核心功能微生物的群落结构的主要因素,而pH、SOM、TK是影响未参与系统土壤氮循环核心功能微生物群落结构的主要因素。综合上述,减量施氮水平下的甘蔗//大豆1:2间作种植模式(SB2-N1)在甘蔗不减产的基础上增加了作物总产量,提升了系统生产力,是一种科学合理的农艺措施。nifH基因和amoA基因的qPCR可作为指示基因可准确鉴定甘蔗//大豆间作系统中DNA-SIP的15N-DNA富集位置,间作能够促进氮循环功能基因的表达,较古菌而言,细菌是甘蔗//大豆间作系统土壤氮循环的主要驱动者,被15N所标记的直接参与土壤氮素循环的微生物与未被标记的微生物群落结构分布有显著差异,且前者群落的分布受土壤中氮素含量的影响。
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