【摘 要】
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分子农业(molecular farming)是指在植物中生产包括药用蛋白和工业蛋白在内的重组蛋白以及其他的次生代谢产物。目前已有多种哺乳动物来源的复杂蛋白在植物中获得了表达,如人血清蛋白、生长激素、抗体、疫苗、细胞因子等。在植物生物反应器的各种表达手段中,利用种子表达系统生产重组蛋白具有很多的优点。作为一种天然的储藏器官,种子提供了一个稳定的环境,适于重组蛋白的长期存储,并且有利于重组蛋白的运输
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分子农业(molecular farming)是指在植物中生产包括药用蛋白和工业蛋白在内的重组蛋白以及其他的次生代谢产物。目前已有多种哺乳动物来源的复杂蛋白在植物中获得了表达,如人血清蛋白、生长激素、抗体、疫苗、细胞因子等。在植物生物反应器的各种表达手段中,利用种子表达系统生产重组蛋白具有很多的优点。作为一种天然的储藏器官,种子提供了一个稳定的环境,适于重组蛋白的长期存储,并且有利于重组蛋白的运输。尽管经过多年的不断发展植物生物反应器已经获得了巨大进步,但是对于不同亚细胞位置定向表达重组蛋白对宿主细胞的内质网质量控制系统的影响却知之甚少。本研究中我们在野生型拟南芥Col-0和糖基化突变体TKO的种子中对抗CD20片段抗体进行了表达。首先我们通过PCR的技术分别将南芥2S2信号肽、大麦Amylase信号肽、内质网滞留信号SEKDEL与片段抗体的编码序列融合,构建了4套不同调控序列的植物表达载体,通过Floral Dip法对拟南芥进行了转化,经平皿筛选后共获得181株不同遗传背景和调控序列的转基因株系。通过Elisa、SDS-PAGE和Western Blot对转基因株系中重组蛋白的表达进行了鉴定。最高的表达量是通过融合拟南芥2S2种子储藏蛋白信号肽获得的,可达到总可溶性蛋白的6.12%。通过Endo H和PNGase F处理,我们对纯化后的几种不同N-糖基结构的重组蛋白进行了N-糖基结构分析。WTC2B8SEKDEL的N-糖基结构成高甘露糖型,TKO背景scFv-Fc不存在岩藻糖及木质糖的修饰,WTC2B82S2的N-糖基结构部分以高甘露糖形式存在,但绝大部分为复杂型。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)实验对重组蛋白的抗肿瘤活性进行了鉴定,结果表明不含有岩藻糖修饰的片段抗体具有更强的ADCC能力,而植物源scFv-Fc的CDC能力较Rituximab有所减弱。最后,在种子发育至13dpa(day post anthesis)时,我们通过qRT-PCR的方法对正常生长条件下和热激后宿主细胞的内质网应激反应进行了分析。基于内质网应激感应因子表达的变化,我们的结果表明在拟南芥种子中内质网定向表达重组蛋白对内质网的稳态施加了更大的压力,并且让其更易受到其他应激因素的胁迫。qRT-PCR的结果同样也表明重组蛋白的表达不仅上调了宿主细胞中ERAD(ER-associated degradation)相关基因的表达,并使其质量控制系统变得更为复杂。而宿主的质量控制系统不仅影响着内源蛋白的合成、修饰和分泌,同时也对重组蛋白的终产量有着巨大的影响,因此研究不同亚细胞位置定向表达对宿主内稳态的影响可以为制定最佳表达策略提供思路,特别是考虑到在商业化种植过程中一些环境因素同样可以造成宿主的内质网应激。
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