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毛囊是哺乳动物生长发育过程中复杂且独特,并一直处于周期性生长的器官。毛囊高度的自我更新能力和明显的结构特征,成为细胞增殖、分化及凋亡等重要生命问题良好的科学模型。兔毛纺织品具有软、暖、细、薄、美和易染色等特点,深受消费者青睐。随着人民生活水平的提高和毛纺织业的不断发展,兔毛的需求量也日益增加,提高兔毛产量和兔毛品质成为目前亟需解决的问题。探寻影响兔毛生长的关键因子,阐明毛囊生长发育的分子机制,对改良毛兔生产性能和提高产业竞争力具有重要意义。长链非编码RNA（Longnon-coding RNAs,lncRNAs）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,一般不具备编码蛋白的能力,lncRNA能够调控细胞增殖、凋亡、分化和迁移等多种细胞活动。目前,在人类、小鼠、山羊等物种上,lncRNA能够通过ceRNA网络、DNA甲基化等途径调控毛囊发育相关通路,影响毛乳头细胞和毛囊干细胞等的细胞周期、增殖与分化。而在家兔中,lncRNA参与毛囊生命活动的机制研究尚未报道。鉴于此,本研究通过全转录组测序筛选毛兔毛囊周期不同发育阶段的差异表达ncRNAs和mRNAs,选取新发现的lncRNA2919为研究对象,从细胞水平和个体水平揭示lncRNA2919在毛囊周期性再生的分子机制,探究lncRNA2919启动子区DNA甲基化的表观遗传学调控模式,以及lncRNA2919-STAT1-KRTAP11-1的trans转录调控网络影响毛囊周期性再生的作用方式,以期从长链非编码RNA的角度补充家兔毛囊发育领域的不足。1.基于全转录组测序筛选毛兔毛囊周期性生长的关键因子为了筛选获取毛兔毛囊发育相关因子,通过剪毛对皖系长毛兔进行毛囊周期同期化处理,构建长毛兔毛囊周期同期化模型。通过毛长测量、石蜡切片HE染色和毛囊发育周期特异性基因LEF1、SFRP2、TGF-β1和KRT16的表达量检测,确定毛兔毛囊周期同期化处理后的0～110天为生长期,120～130天和140～150天分别为退行期和休止期。选取不同毛囊周期阶段（90天、130天和150天）的背部皮肤进行全转录组测序,筛选毛囊周期相关的差异表达ncRNAs和mRNAs,共筛选得到111个差异表达lncRNAs（lncRNA2690、lncRNA2919、lncRNA3354 和 lncRNA5484）、247 个差异表达 circRNAs（novelcirc0004876、、novelcirc0026326、novelcirc0034968和 novelcirc0036671）、97 个差异表达 miRNAs（miR-128-3p、miR-200a-3p、miR-27a-3p 和 miR-320-3p）和 1168个差异表达mRNAs（BMP2、HTATIP2、KRT17和SIAH1）。并进一步利用实时荧光定量PCR验证差异表达ncRNAs和mRNAs在毛囊周期不同阶段的表达量与全转录组测序结果相一致。通过GO富集分析,发现差异表达ncRNAs与mRNAs主要富集于毛囊周期、毛囊发育调控和皮肤发育等皮肤与毛囊发育相关GO terms,KEGG信号通路分析显示差异表达的ncRNAs与mRNAs主要富集于Wnt signaling pathway、Hedgehog signaling pathway和MAPK signalingpathway等毛囊生长发育相关信号通路。同时构建lncRNA-miRNA-mRNA 和 circRNA-miRNA-mRNA 的 ceRNA 调控网络,进一步了揭示ncRNAs与mRNA在毛囊周期发育过程中的互作调控。结果中,lncRNA2919能够在长毛兔毛囊周期发育的退行期高度表达,可作为进一步探究毛囊周期发育过程的关键因子。2.lncRNA2919的鉴定及其对毛兔毛囊生长的影响根据全转录组测序结果,选取lncRNA2919作为候选lncRNA。通过RACE实验获取lncRNA2919全长序列,为1933bp,位于14号染色体161144649～161147952位置,生物信息学预测与标签载体验证lncRNA2919不具备编码蛋白的能力,细胞核质分离实验显示lncRNA2919主要定位于细胞核。在家兔毛乳头细胞（Dermal papilla cell,DPC）中lncRNA2919能够极显著下调BMP2、CCND1、LEF1和WNT2基因的表达量（P<0.01）,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。合成lncRNA2919过表达和敲减腺病毒载体,皮下注射至长毛兔毛囊周期同期化模型的背部皮肤中,结果表明lncRNA2919能够使长毛兔毛囊密度减少,毛囊深度明显降低,延缓毛干生长,延长休止期向生长期的过渡,进而抑制毛囊的周期性再生,并能够极显著上调FGF5、KRTAP11-1和STAT1的mRNA表达水平（P<0.01）,极显著下调LEF1和WNT2的表达量（P<0.01）,显著下调BCL2和CCND1的表达量（P<0.05）,说明lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程中起到负调控作用。3.DNA甲基化阻止EGR1结合lncRNA2919启动子区,影响其转录调控为揭示lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程中上游启动子区的调控机制,通过BSP技术检测长毛兔毛囊周期不同阶段的lncRNA2919启动子区甲基化程度。结果表明lncRNA2919启动子区的两个CpG island中,其中CpG island 2的CpG3位点与lncRNA2919在毛囊周期不同阶段的表达呈显著负相关（Pearson相关系数为-0.99）。通过甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dc对DPC进行去甲基化处理,发现其能够极显著抑制DNMT1的表达量（P<0.01）,同时极显著提高细胞中lncRNA2919的表达量（P<0.01）,说明DPC中lncRNA2919处于高甲基化状态。进一步,荧光素酶报告基因对lncRNA2919启动子区进行活性检测,显示lncRNA2919启动子区-2069～-849位置活性值最高,5-Aza-dc处理后该区域活性显著增加,且CpGisland2的CpG3位点位于该区域。经预测,CpGisland 2 的 CpG3 位点为早期生长反应因子（Early growthresponse 1,EGR1）转录因子结合位点。为此,利用点突变、双荧光素酶与EMSA实验证明EGR1特异性结合于lncRNA2919启动子区域（-1121～-1108）,显著上调lncRNA2919的启动子区活性（P<0.05）。利用去甲基化处理和EGR1过表达均能显著上调DPC中lncRNA2919的表达水平（P<0.01）。以上结果揭示DNA甲基化调节EGRl结合lncRNA2919启动子区,调控lncRNA2919的转录,进而参与毛兔毛囊再生过程。4.lncRNA2919招募STAT1形成复合物,调控KRTAP11-1转录表达进一步分析lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程下游信号途径,利用RNA pull-down和质谱技术筛选lncRNA2919的互作蛋白,发现了信号转导与转录激活子1（Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1）和角蛋白 16（Keratin 16,KRT16）等毛囊发育相关蛋白。同时lncRNA2919的过表达能够极显著提高STAT1 mRNA和蛋白水平的表达量（P<0.01）,RIP实验证明STAT1与lncRNA2919存在结合关系。根据前期全转录组中trans/cis调控模式预测,发现lncRNA2919与KRTAP11-1基因存在trans调控关系。经预测lncRNA2919位于KRTAP11-1基因下游约160kb处,在毛囊周期不同阶段lncRNA2919与KRTAP11-1基因呈显著正相关（Pearson相关系数为0.96）,过表达lncRNA2919能极显著上调KRTAP11-1的mRNA表达水平（P<0.01）。KRTAP11-1在DPC中能够极显著上调KRT16和KRT17（P<0.01）,极显著下调LEF1、WNT2、CCND1和BCL2的mRNA表达量（P<0.01）,并抑制DPC增殖,促进DPC凋亡。进一步,荧光素酶活性检测表明KRTAP11-1启动子区-2490～-2160区段为启动子核心区域,转录因子预测显示STAT1位于此核心区域,qRT-PCR结果显示STAT1的过表达能够极显著促进KRTAP11-1的表达水平（P<0.01）。通过点突变、双荧光素酶活性与EMSA检测,确定STAT1能够结合启动子区显著上调KRTAP11-1的转录活性（P<0.05）。综合互作蛋白分析与trans关系验证,证明lncRNA2919招募STAT1形成复合物结合于KRTAP11-1启动子区,即通过lncRNA2919-STAT1-KRTAP11-1的trans调控轴,参与长毛兔的毛囊周期性再生。