论文部分内容阅读
[研究目的]嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T)疗法是一种通过对T细胞进行基因改造来实现肿瘤靶向杀伤的免疫治疗技术。目前CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤方面已经取得了很好的疗效。但是在CAR-T细胞制备的过程中CAR基因导入的方法主要是病毒转染。在病毒转染的过程中,无论是制备成本、致病性还是潜在的插入诱变可能性都在临床应用中存在着显著的监管障碍。本实验室自主构建的人工抗原提呈细胞(Artificial antigen presenting cell,aAPC)能够作为饲养细胞于体外特异性刺激CAR-T细胞的增殖,不仅提高了扩增效率,还能够减少外源细胞因子及磁珠的使用量,降低实验成本,可大幅减轻临床患者的经济负担。为了避免病毒转染体系的不足之处,本实验中所应用的CAR-T细胞是通过piggyBac转座子转化体系所转染,并由aAPC于体外刺激培养所制备的。因此本实验的目的是研究转座子转化体系制备并由aAPC刺激增殖这一新的制备体系下生产的CAR-T细胞其体内杀瘤活性及安全性。作为临床前实验,充分证明该培养体系下制备的CAR-T细胞具有显著的体内杀瘤活性,从而推动该治疗方案早日进入临床阶段。本研究的主要内容及实验结果如下所示:[实验方法]本研究中涉及小鼠的所有实验都经过昆明医科大学附属延安医院动物伦理委员会批准。一、移植瘤小鼠动物模型的构建选用含有荧光素酶报告基因(Luciferase)的NAMALWA和Raji两种特异性表达CD19抗原的人Burkitt’s淋巴瘤细胞作为构建淋巴瘤小鼠荷瘤模型所用的肿瘤细胞,并用SCID小鼠和NOD-SCID小鼠分别作为构建小鼠模型所用的小鼠品系,构建人Burkitt’s淋巴瘤荷瘤小鼠模型。小鼠模型构建完成后通过小动物活体荧光成像系统检测(In vivo fluorescence imaging system,IVIS)肿瘤细胞在小鼠体内的生长及分布情况。待小鼠发病后处死小鼠并通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测和血涂片检查确认成功构建了人Burkitt’s淋巴瘤小鼠模型。二、抗CD19CAR-T体内杀瘤活性研究在成功构建Burkitt’s淋巴瘤小鼠模型后,向淋巴瘤模型小鼠体内注射新培养体系制备的抗CD19CAR-T细胞,并通过小动物活体荧光成像系统和流式细胞术检测注射CAR-T细胞组小鼠和注射生理盐水组小鼠体内肿瘤细胞的数量及分布情况,从而研究piggyBac转座子与aAPC构建培养体系下的抗CD19 CAR-T在小鼠体内的杀瘤活性。三、抗CD19 CAR-T及aAPC体内安全性研究观察注射CAR-T细胞的荷瘤小鼠的生存状态和体重改变,并在适当时间处死小鼠后观察小鼠各脏器的病理切片是否出现器质性病变从而判断小鼠有无不良反应发生。向小鼠静脉内注射辐照及未辐照的aAPC并通过流式细胞检测小鼠体内aAPC的数量以及观察小鼠的生存状态来验证aAPC的安全性。[实验结果]一、移植瘤小鼠动物模型的构建小动物活体荧光成像系统和流式细胞术检测到小鼠体内肿瘤细胞的存在及分布情况,并且肿瘤细胞不断在体内增殖、扩散,最终导致小鼠发病死亡。二、抗CD19 CAR-T体内杀瘤活性验证注射piggyBac转座子转化系统制备和aAPC体外刺激、培养的抗CD19 CAR-T细胞的小鼠体内肿瘤细胞数量较对照组显著减少,生存时间也显著延长。三、抗CD19 CAR-T及aAPC体内安全性研究注射piggyBac转座子转化系统制备和aAPC体外刺激、培养的抗CD19 CAR-T细胞的小鼠并未发生明显的不良反应,病理切片中各脏器无明显器质性病变。辐照后的aAPC在小鼠体内无明显增殖,流式细胞术未检测到其残留。[研究结论]一、移植瘤小鼠动物模型的构建成功构建了两种特异性表达CD19的人Burkitt’s淋巴瘤小鼠荷瘤模型二、抗CD19的嵌合抗原受体T细胞体内杀瘤活性验证通过piggyBac转座子转化系统制备和aAPC体外刺激、培养的抗CD19 CAR-T细胞对小鼠具有一定的杀伤活性,可以延长小鼠的生存时间。三、抗CD19的嵌合抗原受体T细胞及人工抗原提呈细胞体内安全性性验证注射抗CD19的CAR-T细胞及辐照过的aAPC后,小鼠无明显不良反应及安全问题。