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目的:建立那屈肝素钙溶剂残留乙醇的测定方法;建立那屈肝素钙分子量及其分布测定方法;建立那屈肝素钙中游离硫酸根的检测方法;建立那屈肝素钙效价测定方法;建立那屈肝素钙中亚硝酸根的检测方法;建立那屈肝素钙中N-NO含量检测方法。方法:1溶剂残留乙醇测定(1)顶空气相色谱法:选用合适的色谱柱,调整顶空瓶平衡温度、平衡时间和柱流量,确定最终的色谱条件。(2)线性范围考察。(3)方法学考察:分别考察测定方法的检测限、定量限、精密度、重复性、回收率。(4)样品乙醇残留测定。2分子量及其分布测定(1)线性关系考察。(2)方法学考察:分别考察测定方法的精密度、重复性、溶液稳定性。(3)样品的分子量及其分布测定。3游离硫酸根测定(1)方法学考察:分别考察测定方法的检测限、定量限、专属性、线性关系、精密度、重复性。(2)样品游离硫酸根测定。4效价测定(1)线性范围考察。(2)方法学考察:分别考察测定方法的Xa和Ⅱa精密度、Xa和Ⅱa重复性、Xa和Ⅱa溶液稳定性。(3)样品的效价测定。5亚硝酸根测定(1)线性范围考察。(2)方法学考察:分别考察测定方法的精密度、检测限、定量限、回收率。(3)样品的亚硝酸根测定。6 N-NO测定(1)线性范围考察。(2)方法学考察:分别考察测定方法的精密度、回收率、检测限、定量限。(3)样品的N-NO测定:用选定的方法测定N-NO。结果:1溶剂残留乙醇测定确定了乙醇残留测定的最佳色谱条件:以6%氰丙苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液的毛细管柱;起始温度为40℃,维持4分钟,以每分钟5℃的速率升温至80℃,维持2分钟;进样口温度为140℃;FID检测器,检测器温度为230℃;顶空瓶平衡温度为80℃,平衡时间为30分钟;分流比为2:1;柱流量:6.85ml/min;进样量:1.0ml。在上述色谱条件下,在15.625~1000μg/ml浓度范围内,乙醇峰面积与乙醇浓度呈良好线性关系,标准曲线方程为:A=3.3×102C+1.28×103,相关系数R2=0.9999。乙醇检测限为1ppm。乙醇定量限为4ppm。该方法精密度RSD为3.9%,重复性RSD为2.0%,平均回收率为101.70%,RSD值为2.8%。三批次样品乙醇测定结果均符合规定。2分子量及其分布测定以保留时间为横坐标,以分子量的对数值为纵坐标绘制标准曲线,得标准曲线方程为:Log(M)=15.1-1.85T+0.107T2-2.22×10-3T3,相关系数R=0.9979。分子量精密度RSD为0.20%,重复性RSD为0.18%,溶液稳定性RSD为0.43%。三批次样品分子量及其分布测定结果均符合规定。3游离硫酸根测定SO2-4的定量限为0.05μg/ml。SO2-4的检测限为0.025μg/ml;专属性试验中硫酸根离子与氯离子、硝酸根离子和磷酸根离子之间均能互相分开,分离度均大于1.5;在0.5~8μg/ml浓度范围内,硫酸根离子的峰面积与硫酸根离子的浓度呈良好线性关系。以SO2-4浓度为横坐标,以SO2-4峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得标准曲线方程为:A=3.67×10-2C-1.50×10-3,相关系数R2=0.9999;硫酸根离子精密度RSD为1.63%,重复性RSD为1.46%。三批次样品硫酸根离子测定结果均符合规定。4效价测定以Xa浓度的对数值为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。得标准曲线方程为:A=-0.862log C-0.466,相关系数R2=0.9903;以Ⅱa浓度的对数值为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。得标准曲线方程为:A=-0.849log C-0.779,相关系数R2=0.9902。Xa效价测定精密度RSD为0.63%,IIa效价测定精密度RSD为2.08%。Xa效价测定重复性RSD为0.40%,IIa效价测定重复性RSD为1.56%。Xa效价测定溶液稳定性RSD为0.48%,IIa效价测定溶液稳定性RSD为2.42%。三批次样品效价测定结果均符合规定。5亚硝酸根测定在0.004μg/ml~0.056μg/ml浓度范围内,亚硝酸根峰面积与亚硝酸根浓度呈良好线性关系,以NO-2浓度为横坐标,以NO-2峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得标准曲线方程为:A=0.468×102C-5.36×10-2,相关系数R2=1。亚硝酸根测定精密度RSD为0.76%,检测限为0.0016μg/ml,定量限为0.004μg/ml。平均回收率为99.04%,RSD为0.69%。三批次样品亚硝酸根测定结果均符合规定。6 N-NO测定NDPA浓度在0.03μg/ml~0.15μg/ml范围内线性关系良好,以NDPA浓度(C)为横坐标,以峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得曲线方程为A=2.16×105C+6.18×103,R2=0.9983(R=0.9991)。N-NO测定精密度RSD为2.27%。平均回收率为99.75%,RSD为0.93%。NDPA的定量限为0.03μg/ml(该溶液相当于N-NO基团浓度约为0.010μg/ml)。NDPA的检测限为0.005μg/ml(该溶液相当于N-NO基团浓度约为0.0017μg/ml)。三批次样品N-NO测定结果均符合规定。结论:对比国内低分子肝素钙质量标准,本文首次建立了离子色谱法检测那屈肝素钙中亚硝酸的方法;首次建立了热能分析仪检测那屈肝素钙中N-NO含量的方法;首次建立了离子色谱法检测那屈肝素钙中游离硫酸根的方法,以上方法均简便可靠,准确灵敏,可作为那屈肝素钙的质量控制方法。同时,对比国内低分子肝素钙质量标准,首次提出按照EP要求对国内低分子肝素进行分子量分布检测。本研究为科学有效的评价并控制低分子肝素的质量提供了科学、规范的质量控制与评价方法。