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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的最主要病因,其参与多种致命性心血管疾病如:心肌缺血、心绞痛、心肌梗塞以及心力衰竭等。如何抑制延缓AS的形成,降低AS性心血管疾病的发生率和死亡率已成为该领域共同努力的目标。AS的形成机制复杂,主要包括以下因素:氧化应激,动脉内皮损伤及功能障碍,泡沫细胞形成以及后续的脂质沉积和血栓形成等。其中氧化应激、内皮功能障碍和泡沫细胞形成均为AS早期的特征性病理变化过程。微小核糖核酸(micro RNAs,mi Rs)是一种由约22个核苷酸组成的RNA小片段,通过与靶基因的信使RNA 3’端结合,有效抑制m RNA的转录与翻译,从而发挥不同的生物学效应。研究证实,mi Rs参与多种心血管疾病,如心肌缺血、心肌纤维化、高血压、糖尿病性心肌病、心力衰竭以及AS等。然而,这些研究仍处于初期阶段,mi Rs调控AS的机制如何,如何利用mi Rs治疗AS都是悬而未决的问题。前期研究结果发现,AS患者血浆中的某些mi Rs较健康志愿者表达存在明显差异。通过生物信息学预测并分析microarray数据,发现这些mi Rs具有一个共同的靶基因,氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)。LOX-1是氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)在细胞膜上的受体,具有清道夫受体的特性。如前所述,AS早期主要表现为氧化应激、内皮功能障碍、泡沫细胞形成以及脂质沉积。因此,本研究针对上述特点,采用科学的筛选方法选取一个最具代表性的mi R,研究其对AS的影响,并进一步探讨其可能的机制。研究内容主要包括以下四个部分:1.AS患者与健康志愿者血浆mi RNA表达比较首先采用microarray技术检测AS患者与健康志愿者血浆mi Rs及m RNAs的表达。发现28个mi Rs以及32个m RNA表达发生明显变化。通过Real-time PCR验证结果发现mi R-98表达变化具有统计学意义。利用生物信息学软件再次验证mi R-98与LOX-1存在结合位点。LOX-1是AS形成中的重要调节因子,提示mi Rs可能通过调控LOX-1表达影响AS的形成。2.体外模拟AS环境评估mi R-98对AS形成的影响为模拟AS的体外环境,本研究使用Ox-LDL干预人主动脉内皮细胞,结果发现随着Ox-LDL浓度的逐步升高(0-10μg/m L),mi R-98的表达逐渐降低,而与此同时,LOX-1的表达逐渐增高。提示LOX-1与mi R-98可能存在密切联系。将mi R-98 mimic和inhibitor转染入细胞,发现LOX-1表达被明显抑制或增强。由于诸多因素参与AS的形成,本研究同时检测了氧化应激反应(活性氧自由基[reactive oxygen species,ROS]),内皮功能相关因子表达(内皮素-1[endothelin-1,ET-1]、内皮型一氧化氮合酶[endothelial nitric oxide synthase,e NOS]、诱导型一氧化氮合酶[inducible nitric oxide synthase,i NOS]),内皮细胞通透性,泡沫细胞形成(巨噬细胞油红O染色)。结果发现,与对照组相比,mi R-98 mimic转染的内皮细胞组ROS、ET-1、i NOS表达降低,e NOS表达增高,泡沫细胞形成减少。mi R-98inhibitor作用与之相反。提示mi R-98可能参与调控AS的形成。3.mi R-98对小鼠AS的影响为模拟AS的体内环境,本研究采用LDLr-/-小鼠模型,并对其注射agomi R-98或antagomi R-98,检测小鼠主动脉LOX-1、ET-1、e NOS、i NOS表达情况,以及其对内皮通透性以及脂质沉积的影响。结果发现,agomi R-98可明显抑制LOX-1、ET-1、i NOS的表达,增加e NOS表达,减少动脉内膜的脂质沉积,并降低内皮通透性改善内皮功能。而antagomi R-98的作用与之相反。进一步提示mi R-98可能参与调控AS的形成。4.验证LOX-1是mi R-98的靶基因为明确LOX-1是否为mi R-98的靶基因,本研究采用荧光素酶报告基因进行检测,结果发现mi R-98 mimic组的荧光强度较对照组明显降低,而相同浓度的mi R-98 inhibitor则明显增高;当点突变LOX-1 3’-UTR后(沉默mi R-98与LOX-1的结合位点),其已被mi R-98 mimic抑制的荧光强度又恢复正常。提示LOX-1是mi R-98的靶基因,其结合位点是LOX-1 3’-UTR上的447-453片段。由此验证了假设并得出结论:mi R-98通过抑制LOX-1表达抑制AS的形成。5.小结miR-98通过抑制其靶基因LOX-1参与调控AS早期的特征性病理变化过程,抑制活性氧自由基生成,抑制ET-1、i NOS,增加e NOS的表达,从而改善动脉内皮功能,以及抑制泡沫细胞形成和动脉内膜脂质沉积。本研究为应用微小RNA预防和治疗AS提供了理论和实验依据。