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目的：
通过体内和体外实验探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠中miR-30b-5p表达水平与Notch信号通路活化以及Th细胞分化之间的关系，阐释miR-30b-5p通过调控Notch信号通路相关分子的表达在葡萄膜炎发生发展中的作用机理，为临床应用小RNA分子治疗葡萄膜炎提供理论依据。
方法：
通过双荧光素酶表达报告系统，探讨miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用。首先在Lewis大鼠的躯干上皮下、后肢两足垫及腹壁两侧各点分别均匀注射200μL含光感受器间维生素A结合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP）、结核菌素（tuberculin,TB），完全弗氏佐剂（Freunds adjuvant，CFA）和无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）的乳糜液，诱导EAU，正常对照（normal control，NC）组大鼠注射等体积的TB和CFA的乳糜液。在体内实验部分，首先将携带miR-30b-5p和携带miR-30b-5p空载体（miR-30b-5p-N）的慢病毒分别注射于EAU大鼠脾脏进行干预处理。Genesis-D眼部照相机每日观察各组大鼠眼部炎症表现，并于免疫后第12d分别将各组大鼠同侧眼球摘取并制备切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，H&E)染色法观察各组大鼠视网膜和睫状体的病理学变化；透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）法观察各组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织的线粒体等细胞器的变化情况；分离免疫后12d的各组大鼠眼组织，通过Notch信号通路PCR Array分析与Notch信号通路调控网络相关的84个基因的变化情况，通过Th17细胞应答PCR芯片分析与Th17调控网络相关的84个基因的变化情况。实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分别检测各组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17基因和蛋白水平的表达；流式细胞仪检测各组织中T淋巴细胞中Th细胞水平的变化情况；免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)和WesTM全自动蛋白表达分析系统分别检测各组织中Notch1和Dll4蛋白的表达情况；在体外实验部分，首先分离免疫后12d的各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，收集T淋巴细胞，然后分别用携带miR-30b-5p慢病毒、miR-30b-5p空载体慢病毒、Notch信号通路抑制剂DAPT和Notch信号通路抑制剂阴性对照DMSO进行干预处理并培养72h。Q-PCR和ELISA分别检测各组T淋巴细胞中Notch1、Dll4、IL-10及IL-17基因和蛋白水平表达的变化。流式细胞仪检测各组织T淋巴细胞中CD4+/CD8+，Th17/Treg比例的变化情况。
结果：
双荧光素酶表达报告检测发现，miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因野生型的RLU值与对照组相比显著下调，Notch1和Dll4基因突变型载体中的RLU值表达水平未见明显改变，提示Notch1和Dll4为miR-30b-5p调控的靶基因。在体内慢病毒感染实验中，免疫后12d，Genesis-D眼部相机观察发现，EAU组和miR-30b-5p-N组大鼠免疫后12d眼部炎症严重，均表现为瞳孔膜闭，积脓和虹膜严重血管扩张充血。miR-30b-5p组大鼠眼部炎症明显轻于EAU组和miR-30b-5p-N组，仅表现为轻度虹膜血管充血。根据临床炎症评分标准显示EAU组大鼠炎症评分为(3.82±0.16)，miR-30b-5p-N组大鼠炎症评分为(3.56±0.31)，miR-30b-5p组大鼠炎症评分为(2.53±0.37)，炎症明显轻于EAU组和miR-30b-5p-N组（均为P＜0.05）。组织病理学检查显示，NC组大鼠眼部组织结构清晰；EAU组与miR-30b-5p-N组大鼠睫状体和视网膜内见大量炎性细胞浸润，眼组织结构紊乱；miR-30b-5p-N组大鼠睫状体和视网膜仅表现为轻中度炎性细胞浸润。透射电镜观察发现，相比于NC组，EAU组及miR-30b-5p-N组大鼠各组织超微结构表现为线粒体出现空泡状及膜破损现象，核周间隙增宽，粗面内质网扩张，细胞核固缩。而miR-30b-5p组各组织超微结构则线粒体未出现明显空泡、膜破损现象，也未见显著核固缩。Notch信号通路PCR Array分析发现，与NC组比较，EAU模型组差异表达mRNA共20个，其中上调基因4个、下调基因16个；miR-30b-5p组差异表达mRNA共18个，其中上调基因4个、下调基因14个；miR-30b-5p-N组差异表达mRNA共14个，其中上调基因3个、下调基因11个。Th17细胞应答PCR芯片检测发现，与NC组比较，EAU组差异表达mRNA共32个，其中上调基因14个、下调基因18个；miR-30b-5p组差异表达mRNA共23个，其中上调基因4个、下调基因19个；miR-30b-5p-N组差异表达mRNA共16个，其中上调基因2个、下调基因14个。Q-PCR检测结果发现，相比于NC组，EAU组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17明显上调表达，miR-30b-5p组大鼠的各组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17也均呈上调表达，但Notch1、Dll4和IL-17的表达水平明显低于EAU组和miR-30b-5p-N组，IL-10的表达水平明显高于EAU组和miR-30b-5p-N组(均为P＜0.05)。ELISA检测结果发现，相比于EAU组，miR-30b-5p组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、Dll4及IL-17蛋白水平呈现明显的下调表达，IL-10蛋白水平上调（均为P＜0.05）；miR-30b-5p-N组与EAU组比较无统计学差异。流式细胞仪检测表明，与EAU组相比，miR-30b-5p组CD4+T细胞和Th17细胞水平显著降低，CD4+/CD8+和Th17/Treg比值也显著降低（均为P＜0.05）。miR-30b-5p-N组与EAU组比较差异无显著性（P＞0.05）。IHC及WesTM全自动蛋白表达分析系统检测结果均显示，相比于NC组，EAU组、miR-30b-5p组以及miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白表达水平呈现明显的上调表达（均为P＜0.05）；相比于EAU组，miR-30b-5p组大鼠各组织中Notch1和Dll4蛋白表达水平呈现下调（均为P＜0.05）；而miR-30b-5p-N组与EAU组比较无统计学差异；在体外慢病毒感染实验中，Q-PCR检测结果发现，免疫后12d，相比于NC组，EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠各组织T淋巴细胞中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17明显上调表达，但miR-30b-5p组的各组织T淋巴细胞中Notch1、Dll4和IL-17的表达水平明显低于EAU组和miR-30b-5p-N组，IL-10的表达水平明显高于EAU组(均为P＜0.05)；ELISA检测结果显示各组T淋巴细胞的Notch1、Dll4、IL-10和IL-17的蛋白表达水平与基因水平基本一致。流式细胞仪检测表明，EAU组、miR-30b-5p组及miR-30b-5p-N组Th17水平明显高于NC组。与EAU组相比，miR-30b-5p组Th17水平均显著降低，CD4+/CD8+和Th17/Treg比值显著降低（均为P＜0.05），比例趋向平衡。miR-30b-5p-N组与EAU组无显著性差异。
结论：
miR-30b-5p的下调表达可使其调控的Notch1和Dll4靶基因的表达水平显著升高，活化Notch信号通路，使CD4+/CD8+和Th17/Treg比例发生紊乱。miR-30b-5p可下调Notch1和Dll4等Notch信号通路相关分子的表达，抑制Notch信号通路的活化，使CD4+/CD8+和Th17/Treg比例趋向平衡，从而影响葡萄膜炎的发生发展。此外，DAPT可有效抑制Notch信号通路相关分子的表达及Th细胞的分化。本研究通过探讨葡萄膜炎发生与miR-30b-5p调控Notch信号通路相关基因表达水平之间的关系，阐释miR-30b-5p通过抑制Notch信号通路活化和影响Th细胞分化，促进全身和眼内免疫环境双平衡治疗葡萄膜炎的作用机理，为临床治疗葡萄膜炎提供新的思路及理论依据。
通过体内和体外实验探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠中miR-30b-5p表达水平与Notch信号通路活化以及Th细胞分化之间的关系，阐释miR-30b-5p通过调控Notch信号通路相关分子的表达在葡萄膜炎发生发展中的作用机理，为临床应用小RNA分子治疗葡萄膜炎提供理论依据。
方法：
通过双荧光素酶表达报告系统，探讨miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用。首先在Lewis大鼠的躯干上皮下、后肢两足垫及腹壁两侧各点分别均匀注射200μL含光感受器间维生素A结合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP）、结核菌素（tuberculin,TB），完全弗氏佐剂（Freunds adjuvant，CFA）和无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）的乳糜液，诱导EAU，正常对照（normal control，NC）组大鼠注射等体积的TB和CFA的乳糜液。在体内实验部分，首先将携带miR-30b-5p和携带miR-30b-5p空载体（miR-30b-5p-N）的慢病毒分别注射于EAU大鼠脾脏进行干预处理。Genesis-D眼部照相机每日观察各组大鼠眼部炎症表现，并于免疫后第12d分别将各组大鼠同侧眼球摘取并制备切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，H&E)染色法观察各组大鼠视网膜和睫状体的病理学变化；透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）法观察各组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织的线粒体等细胞器的变化情况；分离免疫后12d的各组大鼠眼组织，通过Notch信号通路PCR Array分析与Notch信号通路调控网络相关的84个基因的变化情况，通过Th17细胞应答PCR芯片分析与Th17调控网络相关的84个基因的变化情况。实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分别检测各组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17基因和蛋白水平的表达；流式细胞仪检测各组织中T淋巴细胞中Th细胞水平的变化情况；免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)和WesTM全自动蛋白表达分析系统分别检测各组织中Notch1和Dll4蛋白的表达情况；在体外实验部分，首先分离免疫后12d的各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，收集T淋巴细胞，然后分别用携带miR-30b-5p慢病毒、miR-30b-5p空载体慢病毒、Notch信号通路抑制剂DAPT和Notch信号通路抑制剂阴性对照DMSO进行干预处理并培养72h。Q-PCR和ELISA分别检测各组T淋巴细胞中Notch1、Dll4、IL-10及IL-17基因和蛋白水平表达的变化。流式细胞仪检测各组织T淋巴细胞中CD4+/CD8+，Th17/Treg比例的变化情况。
结果：
双荧光素酶表达报告检测发现，miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因野生型的RLU值与对照组相比显著下调，Notch1和Dll4基因突变型载体中的RLU值表达水平未见明显改变，提示Notch1和Dll4为miR-30b-5p调控的靶基因。在体内慢病毒感染实验中，免疫后12d，Genesis-D眼部相机观察发现，EAU组和miR-30b-5p-N组大鼠免疫后12d眼部炎症严重，均表现为瞳孔膜闭，积脓和虹膜严重血管扩张充血。miR-30b-5p组大鼠眼部炎症明显轻于EAU组和miR-30b-5p-N组，仅表现为轻度虹膜血管充血。根据临床炎症评分标准显示EAU组大鼠炎症评分为(3.82±0.16)，miR-30b-5p-N组大鼠炎症评分为(3.56±0.31)，miR-30b-5p组大鼠炎症评分为(2.53±0.37)，炎症明显轻于EAU组和miR-30b-5p-N组（均为P＜0.05）。组织病理学检查显示，NC组大鼠眼部组织结构清晰；EAU组与miR-30b-5p-N组大鼠睫状体和视网膜内见大量炎性细胞浸润，眼组织结构紊乱；miR-30b-5p-N组大鼠睫状体和视网膜仅表现为轻中度炎性细胞浸润。透射电镜观察发现，相比于NC组，EAU组及miR-30b-5p-N组大鼠各组织超微结构表现为线粒体出现空泡状及膜破损现象，核周间隙增宽，粗面内质网扩张，细胞核固缩。而miR-30b-5p组各组织超微结构则线粒体未出现明显空泡、膜破损现象，也未见显著核固缩。Notch信号通路PCR Array分析发现，与NC组比较，EAU模型组差异表达mRNA共20个，其中上调基因4个、下调基因16个；miR-30b-5p组差异表达mRNA共18个，其中上调基因4个、下调基因14个；miR-30b-5p-N组差异表达mRNA共14个，其中上调基因3个、下调基因11个。Th17细胞应答PCR芯片检测发现，与NC组比较，EAU组差异表达mRNA共32个，其中上调基因14个、下调基因18个；miR-30b-5p组差异表达mRNA共23个，其中上调基因4个、下调基因19个；miR-30b-5p-N组差异表达mRNA共16个，其中上调基因2个、下调基因14个。Q-PCR检测结果发现，相比于NC组，EAU组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17明显上调表达，miR-30b-5p组大鼠的各组织中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17也均呈上调表达，但Notch1、Dll4和IL-17的表达水平明显低于EAU组和miR-30b-5p-N组，IL-10的表达水平明显高于EAU组和miR-30b-5p-N组(均为P＜0.05)。ELISA检测结果发现，相比于EAU组，miR-30b-5p组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、Dll4及IL-17蛋白水平呈现明显的下调表达，IL-10蛋白水平上调（均为P＜0.05）；miR-30b-5p-N组与EAU组比较无统计学差异。流式细胞仪检测表明，与EAU组相比，miR-30b-5p组CD4+T细胞和Th17细胞水平显著降低，CD4+/CD8+和Th17/Treg比值也显著降低（均为P＜0.05）。miR-30b-5p-N组与EAU组比较差异无显著性（P＞0.05）。IHC及WesTM全自动蛋白表达分析系统检测结果均显示，相比于NC组，EAU组、miR-30b-5p组以及miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白表达水平呈现明显的上调表达（均为P＜0.05）；相比于EAU组，miR-30b-5p组大鼠各组织中Notch1和Dll4蛋白表达水平呈现下调（均为P＜0.05）；而miR-30b-5p-N组与EAU组比较无统计学差异；在体外慢病毒感染实验中，Q-PCR检测结果发现，免疫后12d，相比于NC组，EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠各组织T淋巴细胞中Notch1、Dll4、IL-10和IL-17明显上调表达，但miR-30b-5p组的各组织T淋巴细胞中Notch1、Dll4和IL-17的表达水平明显低于EAU组和miR-30b-5p-N组，IL-10的表达水平明显高于EAU组(均为P＜0.05)；ELISA检测结果显示各组T淋巴细胞的Notch1、Dll4、IL-10和IL-17的蛋白表达水平与基因水平基本一致。流式细胞仪检测表明，EAU组、miR-30b-5p组及miR-30b-5p-N组Th17水平明显高于NC组。与EAU组相比，miR-30b-5p组Th17水平均显著降低，CD4+/CD8+和Th17/Treg比值显著降低（均为P＜0.05），比例趋向平衡。miR-30b-5p-N组与EAU组无显著性差异。
结论：
miR-30b-5p的下调表达可使其调控的Notch1和Dll4靶基因的表达水平显著升高，活化Notch信号通路，使CD4+/CD8+和Th17/Treg比例发生紊乱。miR-30b-5p可下调Notch1和Dll4等Notch信号通路相关分子的表达，抑制Notch信号通路的活化，使CD4+/CD8+和Th17/Treg比例趋向平衡，从而影响葡萄膜炎的发生发展。此外，DAPT可有效抑制Notch信号通路相关分子的表达及Th细胞的分化。本研究通过探讨葡萄膜炎发生与miR-30b-5p调控Notch信号通路相关基因表达水平之间的关系，阐释miR-30b-5p通过抑制Notch信号通路活化和影响Th细胞分化，促进全身和眼内免疫环境双平衡治疗葡萄膜炎的作用机理，为临床治疗葡萄膜炎提供新的思路及理论依据。