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背景和目的:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)被公认是常见而难治的恶性肿瘤之一。其发病隐匿,早期发生浸润和转移,生存期较短、病死率较高,目前临床采用的传统治疗手段包括:手术切除、放化疗、肝移植和介入治疗,疗效均不理想。分子靶向治疗和生物免疫治疗是目前研究的热点,具有高效、特异和低毒等的特点,也给晚期HCC患者带来新的希望。近期多项临床研究结果显示,索拉菲尼(Sorafenib)作为一种多激酶抑制剂,可以通过抑制血管内皮生长因子受体等而阻断肿瘤新生血管的形成,间接抑制肿瘤细胞的生长,并成为第一个被证实能改善晚期HCC患者生存的药物。机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切的关系,个体免疫功能低下或免疫缺陷时,肿瘤的发病率明显增多,而恶性肿瘤患者的免疫功能不全更是普遍现象。在机体免疫中扮演重要角色的巨噬细胞(Macrophage,Mφ)和自然杀伤(natural killer,NK)细胞,同样在抑制肝癌形成、生长、转移中发挥重要作用。索拉菲尼显著抑制HCC作用是否存在免疫调节的分子机制,目前并不清楚。本实验采用改良的方法建立了大鼠HCC模型,动态观察Raf、Tec等信号分子在肝癌形成过程中的表达变化情况,并在HCC形成早期和晚期使用单-双倍剂量的Sorafenib进行干预,采用免疫组化、Western Blot等方法动态观察其对HCC组织Mφ、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+T细胞的影响,从免疫细胞的角度来探讨Sorafenib抗肝癌作用中可能存在的免疫分子机理。研究内容与方法1.采用改良的方法建立二乙基亚硝胺诱发Wistar大鼠HCC模型;利用H-E染色、免疫组织化学、RT-PCR和Western Blot等方法动态观察Raf、Tec等信号分子在肝癌形成过程中的表达变化情况。2.在模型HCC形成早期和晚期使用单-双倍剂量的Sorafenib进行干预,采用免疫组化、Western Blot方法动态观察其对HCC组织Mφ、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8 +T细胞的影响,并观察Sorafenib对免疫功能影响的量效关系和肝功能损伤情况。研究结果1.改良方法建立动物模型1.1生存情况:传统方法组大鼠从第12周开始相继出现死亡,截止实验结束时死亡率为19.05%(8/42),改良方法组死亡1只,死亡率为2.38%(1/42),两者相比连续校正的P值为0.034,有统计学意义。1.2病理变化:正常大鼠肝脏表面光滑,未见结节。实验组(传统方法组和改良方法组)的大鼠由开始的表面光滑,到粗糙,再到结节出现,结节直径大小不一,个别呈巨大型,直径达15mm,有的呈弥漫分布,有的散在存在。镜下,正常对照组大鼠肝脏亦无变化。传统方法组和改良方法组的肝脏均呈现出肝炎-肝硬化-肝癌的变化规律。1.3肝指数:传统方法组大鼠肝指数在第18周时达到峰值,之后略有下降但维持在一定水平。改良方法组12-16周数据显示虽有所下降,但总的趋势是逐渐升高的,而正常对照组一直维持在较低的水平。正常对照组和实验组(传统方法组和改良方法组)的平均值在18周后相比均有显著性差异。2.诱癌过程中有关信号分子的表达以及索拉菲尼干预后的表达变化情况在单纯模型组中,随着诱癌时间的延长,Raf、Tec蛋白的表达呈现逐渐增加的趋势,索拉菲尼干预后,尤其是早期双倍组Raf、Tec蛋白表达下降明显(P<0.05,与同期单纯模型组比较),P53的表达虽趋于下降,但与同期单纯模型组无统计学意义。3.诱癌过程中Mφ、NK细胞以及索拉菲尼干预后的变化CD57、CD68阳性细胞的数目单纯模型组逐渐增加,其他实验组(早期单倍组、早期双倍组、晚期单倍组、晚期双倍组)分别地在第12、14周时出现峰值后出现不同程度的减少,而早期双倍组、晚期双倍组在第18周后两者数目减少不明显,其中第20、22周时早期双倍组、晚期双倍组分别与单纯模型组相比均有显著增加(P值均<0.05),同时早期双倍组比早期单倍组,晚期双倍组比晚期单倍组以及早期双倍组比晚期双倍组亦有显著增加(P值均<0.05),其余各组之间无明显差异。4.诱癌过程中CD4+ T细胞、CD8 +T细胞以及索拉菲尼干预后的变化实验组(包括传统方法组和改良方法组)的CD4+T细胞数量和CD4+T/CD8+T比值从第10开始是逐渐降低的(第10周和第22周相比,P均<0.01),CD8+T细胞数量从第10开始是逐渐升高的(P<0.05)。索拉菲尼干预后和未施加干预未见明显差别。5.肝功能损伤早期单倍剂量组较单纯模型组肝功能损伤减轻,无显著性差异;早期双倍剂量组比单纯模型组损伤减轻,但有显著性差异。结论:1.索拉菲尼不仅可以抑制肝癌组织局部的血管生成,还可以下调Raf、Tec等胞内信号蛋白激酶的表达。2.索拉菲尼可能诱导Mφ、NK细胞向HCC组织发生移动聚集,逆转HCC组织局部的免疫抑制,可能是其抗肿瘤作用的免疫分子机理之一。3.索拉菲尼对肝细胞癌中Mφ、NK细胞的影响呈一定剂量依赖关系,而单-双倍剂量对肝功能损伤无显著性差异。