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PARTⅠ:重庆地区婴幼儿重症肺炎常见呼吸道病毒病原分析目的了解重庆地区婴幼儿重症肺炎中常见呼吸道病毒感染及其协同感染情况。方法2006年12月至2008年3月,于ICU病房收集诊断为重症肺炎患儿的深部气道或机械通气气管导管内吸取物标本119份,采用RT-PCR或PCR方法检测人偏肺病毒(hMPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(hBoV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒(PIV)1、2、3和流感病毒(IV)A、B等呼吸道病毒病原。结果119份标本中病毒总检出例数为86例(72.3%),其中RSV检出率最高,为41.2%(49/119)；hMPV为19例(16.0%)。有2种及以上病毒协同感染23例,占26.7%(23/86)；RSV阳性中有19例存在协同感染,占38.8%(19/49)；hMPV为8例42.11%(8/19)。69例行细菌检测,其中53例为阳性,阳性率为76.1%。这69例标本中,病毒阳性率为76.8%；病毒细菌双阳性为41例,占59.4%。结论(1)病毒感染是重庆地区婴幼儿重症肺炎的重要病因。(2)RSV是婴幼儿重症肺炎最常见病毒病原,其次为ADV和hMPV。(3)病毒的协同感染在重症呼吸道患儿中可能较为普遍,但尚无证据说明病毒协同感染可加重病情。PARTⅡ:绿色荧光标记重组偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立目的建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法。方法基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入包装细胞293T后获得感染性重组hMPV。GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存。将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂糖凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,荧光显微镜下计数荧光空斑数和免疫染色两种方法同时进行,计算空斑形成单位。结果感染后3天,GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3天荧光空斑相对独立,便于计数。此前拯救获得的重组hMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×106以上。结论成功建立了GFP-hMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础。PARTⅢ:BALB/C和SCID小鼠人偏肺病毒的感染特点目的比较研究BALB/C小鼠和SCID小鼠hMPV感染的特点,为hMPV感染免疫发病机制及疫苗研究奠定基础。方法GFP-rhMPV滴鼻感染BALB/C小鼠和SCID小鼠,于感染后3、5、7、9、14天处死小鼠并无菌获取心、肝、脾、肺、肾和脑用于病毒分离和病理检查,空班形成法检测病毒滴度,RT-PCR和Real-timePCR法检测hMPV mRNA表达。结果GFP-rliMPV滴鼻感染BALB/C小鼠和SCID小鼠后第5天肺组织分离到病毒。感染GFP-rhMPV的BALB/C和SCID小鼠在感染后第5天肺组织病毒滴度达峰值,(5.25±1.69)×104PFU/g和(5.83±1-21)×105 PFU/g,SCID小鼠在感染后第14天肺组织内病毒滴度仍可达(4.25±1.04)×101PFU/g,此时BALB/C鼠肺内已不能分离到病毒,但可检测到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表达。感染后第5天所有小鼠的心、肝、脾、肾和脑组织悬液不能分离到病毒,也不能检测到hMPVF蛋白mRNA的表达。肺组织病理改变在感染后5天明显,为典型的间质性肺炎改变,BALB/C小鼠组肺组织病理评分略低于SCID小鼠组,但差异没有统计学意义。结论(1)GFP-rhMPV滴鼻感染后只能在肺组织中复制,在其他组织中不能复制。(2)同BALB/C小鼠相比,SCID小鼠感染GFP-rhMPV后病毒滴度高,复制时间久；但病理损伤没有显著性差异。PARTⅣ:糖基化位点突变的人偏肺病毒感染SCID小鼠的研究目的通过GFP-rhMPV F蛋白N-糖基化位点发生突变的几种毒株间的比较研究,初步探讨hMPVF蛋白表面的N-糖基化位点改变对病毒毒力及其致病性的影响。方法GFP-rhMPV滴鼻感染SCID小鼠,于感染后3、5、7、9、14d处死小鼠并无菌获取心、肝、脾、肺、肾和脑用于病毒分离和病理检查,空班形成法检测病毒滴度,RT-PCR和Real-time PCR法检测GFP-rhMPV mRNA表达。结果M1、M2、M4滴鼻感染SCID小鼠后第5天肺组织分离到病毒。肺组织内M1病毒滴度在感染后5d达到高峰,为(5.92±0.92)×105 PFU/g,感染后14d仍能检测到病毒,滴度可达(0.67±0.52)×102PFU/g。M2感染小鼠后第3天没有分离到病毒,第5天才分离到病毒,滴度为(0.33±0.26)×101PFU/g,第9天时滴度为(0.58±0.58) PFU/g。M4感染小鼠后第3天肺内病毒滴度最(0.50±0.45)×101PFU/g,感染后第9天肺内已不能分离到病毒,但可检测到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表达。感染GFP-rhMPV后第5天所有小鼠的心、肝、脾、肾和脑组织悬液不能分离到病毒,也不能检测到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表达。肺组织病理改变在感染后5天明显,为典型的间质性肺炎改变。小鼠肺组织病理评分同野生型相比,M1组差异没有统计学意义(P>0.05),M2、M4组差异有统计学意义(P<0.05)；同M1相比,M2、M4组差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)M1、M2、M4滴鼻感染后只能在肺组织中复制,在其他组织中不能复制。(2)同野生型相比,M1复制能力和复制时间没有明显变化；M2、M4复制能力明显降低,尤其是M4在体内的复制时间明显缩短。(3)相比野生型和M1,M2和M4所致的小鼠肺组织病理损伤明显较轻,差异有统计学意义。