活性海洋真菌的筛选及其代谢产物的初步研究

来源 :温州医学院 温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangxinyu322
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本论文采用菌饼法和琼脂挖块法,以副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolycis)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、创伤弧菌(V.vulnificus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、灿烂弧菌(V.splendidus)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)为指示菌,对分离自南麂岛近海的沉积物真菌进行抑菌活性筛选,对具有较强抑菌活性的NJ0104菌株的发酵工艺、抑菌活性物质的理化性质和生物活性进行了研究。采用柱层析和薄层层析法对菌株NJ0104的代谢产物进行初步分离和活性部位的鉴定,获得了初步的研究结果。   首先开展活性菌株的分离筛选,采用常规的稀释平板法,从南麂岛海域海洋沉积物中共分离获得真菌78株,从中筛选出代谢产物对海水养殖生物病原菌有抑制作用的海洋真菌9株,活性菌株占到供测菌株的11.5%。在9株活性菌株中,其中编号为NJ0104的菌株对多种海水养殖生物致病菌均有抑制作用,且对副溶血弧菌表现出了较强的抑制活性。因此,确定此菌株做为进一步研究的对象。   为了使菌株培养过程中抑菌活性物质的产量最大化,本论文对菌株NJ0104的发酵工艺进行了优化。首先确定了菌株发酵的最佳基础培养基,进而考察了海水浓度、碳氮源及其浓度、发酵培养时间、发酵液初始pH值和摇床转速对菌株产抑菌活性物质的影响,并通过正交试验对培养基碳氮源组成配比进行了优化。最终确定菌株NJ0104的最佳培养基组成为:葡萄糖2%,酵母粉1.5%,味精2%,玉米粉0.5%,KH2PO40.05%,60%海水1000mL。适宜的培养条件为:初始pH7.0,培养时间6d,摇床转速为160r/min。对优化后工艺进行验证的结果显示:抑菌圈有原来的25.5mm增加至30.3mm,有效地提高菌株合成抑菌活性代谢产物的能力。   对菌株NJ0104所产抑菌活性物质的理化性质进行了初步探讨。研究表明,该抑菌活性物质具有较强的热稳定性,在酸性近中性条件下稳定,碱性条件下不稳定,活性物质难溶于极性小的有机溶剂石油醚和氯仿,可溶于乙酸乙酯和正丁醇。这些结果为下一步的分离提取提供了依据。   对活性菌株进行了大量发酵,采用乙酸乙酯和正丁醇对发酵液中的抑菌活性代谢产物进行了提取,并对乙酸乙酯和正丁醇提取物进行了生物活性检测。结果显示:乙酸乙酯相对5种病原指示菌抑菌能力均强于正丁醇相,在5种病原菌中,副溶血弧菌对乙酸乙酯相和正丁醇相均最为敏感,MIC值分别为2g/L和4g/L;乙酸乙酯相和正丁醇相均具有一定的ABTS自由基抑制活性,乙酸乙酯相的自出基清除能力强F正丁醇相。   采用柱层析和薄层层析法对提取物中的抑菌活性物质进行初步分离,获得了5个活性组分,从其中的Fr.3组分中又获得了5个组分,其中组分Fr.3-3和Fr.3-5有抑菌活性。
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