由血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)产生的漆酶耐热性能良好,具有重要工业应用价值,但该菌所产漆酶活力较低,不适于规模化生产。本文采用基因重组技术,使外源漆酶基因在里氏木霉(Trichoderma reesei)中高效表达,并对重组里氏木霉的产酶性能及其在秸秆、有机污染物降解方面的应用进行了研究,主要结果如下:根据里氏木霉的密码子偏好性对来自血红密孔菌的漆酶基因进行了优化,并将其与里氏木霉强启动子Pcbh1、终止子Tcbh1和潮霉素抗性基因连接得到重组质粒pCH-1ac;再通过农杆菌介导技术,将此质粒转化到里氏木霉细胞中。对影响农杆菌介导转化效率的主要因素进行了研究,发现在共培养温度24 ℃,共培养基pH5.2,里氏木霉孢子浓度为107个/mL,共培养周期为60h条件下,介导转化效率最高。通过潮霉素抗性筛选及复筛得到9个重组转化子。对重组里氏木霉染色体DNA进行聚合酶链式反应(PCR)验证,表明外源漆酶基因已成功整合到里氏木霉的基因组上并可以稳定遗传。对转化子发酵液进行的SDS-PAGE蛋白电泳结果显示:在大约66kDa处有一个明显的条带,与血红密孔菌所产漆酶的条带相符,说明漆酶基因已在里氏木霉细胞中成功表达,其表达产物可以分泌到胞外。重组里氏木霉产漆酶实验在摇瓶条件下进行,通过培养基和发酵条件的优化,重组漆酶活力在96 h达到8.8 IU/mL。进一步采用分批补料式发酵,可使漆酶活力提升至20.3 IU/mL。这一研究结果为漆酶的规模化生产奠定了坚实的基础。重组漆酶的酶学性质研究表明:重组漆酶在50-75 ℃之间有明显催化活性,最适反应温度为65 ℃,在70 ℃条件下的热稳定性明显高于血红密孔菌漆酶,推测其原因可能是里氏木霉具有较好的糖基化系统,有利于维持酶蛋白的稳定性。重组漆酶最适反应pH为2.2,在pH 2.0-2.6之间有明显催化活性,在pH 2.2-4.2的条件下放置4 h,残留酶活力仍高于80%。该酶对一些金属离子和有机溶剂具有较好的耐受性,对底物2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)有较强的亲和性。重组里氏木霉在利用甘蔗渣、稻草等植物纤维原料进行固态发酵过程中,不但可以产生高活力的纤维素酶、木聚糖酶,还可以产生高活力的漆酶,有利于木质纤维素原料的快速降解。当以甘蔗渣为底物时,每克干基中漆酶、纤维素酶(滤纸酶活力,FPA)和木聚糖酶的活力分别可达16.4 IU、89.2 IU和3830 IU;发酵第12天甘蔗渣中的纤维素、半纤维素和木质素降解率分别为80.2%、58.7%和31.7%,甘蔗渣总失重达57.1%,为原始里氏木霉的1.5倍。当以稻草为底物时,每克干基中漆酶、纤维素酶(FPA)和木聚糖酶的活力分别可达8.1 IU、132.2 IU和5504 IU;发酵第12天稻草纤维素、半纤维素和木质素降解率分别为75.6%、57.2%和28.6%,稻草总失重达55.4%,为原始里氏木霉的1.6倍。用重组漆酶对印染废水进行脱色实验研究,发现该酶对蒽醌类染料弱酸性紫N-FBL和活性艳蓝KN-R具有明显的脱色作用,在不添加介体的情况下,脱色率均可达91%以上;对于偶氮类染料苋菜红,在0.1 mM天然介体丁香醛参与的情况下,脱色率高达92.2%。利用重组漆酶/ABTS体系对内分泌干扰物双酚A及三氯生进行降解实验,双酚A、三氯生的降解率分别达到了 95%和81%。本文所构建的重组里氏木霉成功实现了外源漆酶基因的高效表达,重组里氏木霉不仅可以高效降解纤维素和半纤维素,还可有效降解植物秸秆中的木质素。由重组里氏木霉生产的漆酶可降解多种有机污染物,在环境污染治理方面具有重要的应用价值。本文的研究成果在秸秆快速降解还田及污染土壤的生物修复方面具有良好的应用前景。