在特殊生境下提取的微生物活性产物研究中,在筛选得到能够产生生物活性代谢产物的微生物过程中,仅有少量的微生物菌株能产生相应的活性,并可以直接应用于次级代谢产物的研究,而绝大多数菌株则在相应的筛选模型中没有表现出相应的活性。如何改造这些无活性菌株的次级代谢功能,进而使其有效地转化为活性菌株,并产生相应的活性次级代谢产物,是本课题所需要研究的重点。核糖体工程及其相关的抗生素抗性筛选技术已被成功地应用在了调控原核微生物领域微生物的次级代谢功能改造上,而通过氨基糖苷类抗生素抗性筛选将无活性真菌野生株转化成活性突变株,仅在本课题组前期工作中,探索性地应用在特殊生境的潮间带真菌产紫青霉G59上,本研究在此基础之上,将抗生素抗性导入真菌细胞的技术应用到另一株深海来源的无活性野生真菌,使其发生活性化转化,得到稳定的具有活性的抗性突变株,通过抗性验证,证明其抗性被稳定的导入,再通过发酵分离得到新产活性化合物并验证之,最终阐明了突变株新产活性产物的研究。本论文以从采集于174.2130°E,24.3444°S(南太平洋斐济周边大洋),水深800米处海泥中提取的无活性真菌ZBY-3,经分类学研究鉴定该菌株为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。采用DMSO与超声介导下的不同浓度的新霉素抗性筛选方法获取突变株,并对突变株进行了抗细菌、抗肿瘤活性筛选。在此基础上对其中1株活性突变株进行了新产活性产物的研究。分离得到杂色曲霉ZBY-3,采用MTT法,以人白血病K562细胞为受试细胞,经初筛和复筛,在100μg/m L样品浓度下没有抗肿瘤作用。这一株无活性菌株则为探索二次开发无活性菌株的相关研究提供了有效的原始菌株。采用超声、DMSO不同的介导方法,对含有不同浓度新霉素的孢子悬液进行处理,结果证实DMSO介导新霉素的抗性筛选方法能获取突变株。通过对菌悬液处理时间、DMSO体积浓度比、新霉素浓度等因素进行考察,进一步完善与补充了DMSO介导的新霉素抗性导入无活性真菌筛选方法,运用氨基糖苷类抗生素对真菌进行抗性筛选,从而将无活性真菌转化为活性菌株资源。通过建立的DMSO介导的新霉素抗性筛选方法对无活性深海来源真菌杂色曲霉ZBY-3进行处理,共分离得到了33株的在形态学上有差异的抗性突变株,其中的12株的发酵产物的乙酸乙酯提取物在100μg/m L时对人慢性髓源性白血病细胞K562细胞有大于30%的抑制增殖生长的活性(占总的抗性突变株数目的 36.4%),并且通过TLC薄层分析,可以看出活性突变株的次级代谢产物中,生成了原始菌株ZBY-3所不能代谢产生的物质,这些结果表明,利用本章节所表述的研究方法,通过DMSO介导下的新霉素导入无活性深海真菌,确实能够改造原始菌株,并获得新的活性次级代谢产物,从而拓展可供研究活性产物的菌株来源。另一方面,通过建立的超声介导下的高浓度新霉素抗性筛选方法对无活性深海来源真菌杂色曲霉ZBY-3进行处理,共分离得到了30株的在形态学上有差异的抗性突变株,通过一系列的抗肿瘤细胞活性测试、抗菌活性测试,17株抗性突变株的次级代谢产物在100μg/m L浓度下对K562细胞抑制率超过30%,活性转化率达56.7%,其中的10株次级代谢产物对K562细胞的抑制率稳定大于50%,另外的7株次级代谢产物对K562细胞的抑制率稳定地介于30%到50%;6株抗性突变株的次级代谢产物在纸片法测量抑菌活性的实验中,750μg/纸片的浓度下,有6株抗性突变株对大肠埃希菌ATCC®25922有抑菌活性,活性转化率达到20%。结合TLC与HPLC-PDAD-UV对比图,以及结合抗性突变株的活性强弱,基于产物的丰富程度,我们选择了200-2003h 1-2作为下一步次级代谢产物研究的对象。针对活性突变株200-200 3h 1-2,我们开展了抗性验证实验,在同样条件下对原始菌株ZBY-3和目标菌株200-200 3h 1-2同时进行抗性试验,从而验证了200-200 3h1-2的新霉素抗性被成功导入。进而对抗性突变株进行大量发酵,并通过活性追踪的方法,将抗性突变株的次级代谢产物与原始菌株进行比对,分离并且纯化原始菌株所不产的,突变株代谢产物中所新产的6个单体化合物:Cyclo(D-Pro-D-Phe)(1)、Cyclo-(D-tyrosyl-D-proline)(2)、Phenethyl 5-oxoprolinate(3)、Cyclo(L-Ile-L-Pro)(4)、Cyclo(L-Leu-L-Pro)(5)、3β,5α,9α-Trihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(6),其中化合物2是新天然产物,化合物3为新化合物。这些产物在100μg/m L对K562,HL60,BGC-823,Hela细胞均有或弱或强的抗肿瘤活性。其中化合物1,2,6对K562细胞的IC50值分别为399.5μM(1),303.7μM(2),221.0μM(6),化合物1,2,3,6对HL-60细胞的IC50值分别为225.6μM(1),254.7μM(2),215.1μM(3),89.1μM(6),化合物1,2,6对BGC-823细胞的IC50值分别为242.2μM(1),328.7μM(2),177.7μM(6),化合物3,6对Hela细胞的IC50值分别为194.5μM(3),224.3μM(6),并且通过HPLC-MS验证了这六个化合物为原始菌株所不生产,而是抗性突变株所新生产的。总而言之,在本研究中,以深海来源无活性野生菌株为原始菌株,在通过DMSO与超声介导下的新霉素抗性导入真菌的基础上,通过体外筛选模型的筛选,实现了无活性菌株的活性化转化,并获得了活性突变株,并阐明了其中一株活性突变株200-2003h 1-2的部分突变株新产活性代谢产物。这一系列研究表明通过对无活性野生真菌进行抗性导入,获得活性抗性突变株,并对其大量发酵,发现新的活性化合物乃至新的活性天然产物。这一研究建立了一条完整的途径,能够将无活性野生菌株转化为有活性菌株,使得人们不再将目光局限于有活性的野生菌株,有效地开拓了有活性的药源微生物菌株新资源,是具有实际可行性和应用价值的研究。