目的通过对人类睾丸组织高表达的四百多个未知功能基因进行大规模基于双荧光素酶活性检测的信号通路筛选,发现了一批激活或抑制信号通路的阳性基因,能够显著上调或下调内参萤火虫荧光素酶活性。从中选择显著抑制NF-κB信号通路的基因HEPIS(Human embryo lung cellular protein interacting with SARSCo V nsp-10,HEPIS)进行功能研究。生物信息学分析HEPIS基因,初步了解其基本理化性质、对应蛋白质的结构并预测其功能;通过半定量-PCR研究HEPIS在不同组织的表达谱;预测和验证HEPIS蛋白的亚细胞定位;分别构建高效HEPIS真核表达质粒和si RNA沉默子,体外瞬时转染肾细胞系293T和肾癌细胞系A498,通过细胞形态及功能的变化探讨HEPIS基因抑制细胞增殖的机制,为开发有重要生理活性及临床应用前景的新功能基因奠定基础。方法1目的基因的筛选:分析海肾/萤火虫荧光素酶双报告基因系统对NF-κB、CRE、Wnt和HRE四条通路大规模筛选的结果,选择HEPIS为本次研究的目的基因。2生物信息学分析:通过各种分析软件和生物信息学预测网站预测分析HEPIS基因的核酸及HEPIS蛋白质的序列组成、理化性质、定位、信号肽、跨膜结构域、物种同源性及二级结构等。3表达谱分析:利用半定量RT-PCR技术检测HEPIS基因的在多个细胞系中的表达谱,选取目的基因对细胞增殖影响研究的适合细胞系。4真核表达质粒的克隆构建:利用分子克隆技术将目的基因HEPIS的CDS区插入到p CMVSPORT6、p EGFPC3、p EGFPN1的真核表达载体上。5亚细胞定位:将HEPIS-p EGFPN1和HEPIS-p EGFPC3分别转染入293T细胞,荧光显微镜下观察融合的绿色荧光蛋白在细胞内位置,推断蛋白定位。6使用引物设计软件针对HEPIS的CDS区设计、合成并扩增针对目的基因的si RNA片段,使之形成Hairpin si RNA结构,有效沉默目的基因,并且通过实验验证沉默与过表达的效率。7功能实验:通过对细胞形态的观察、克隆形成、划痕实验、CCK8试剂盒检测等来验证过表达和沉默HEPIS对肾细胞系293T以及肾癌细胞系A498增殖的影响。8 HEPIS抑制细胞增殖的机理:首先通过转染使HEK293T细胞过表达或沉默HEPIS,然后利用血清饥饿培养使细胞周期同步化,最后通过流式细胞术检测细胞周期,明确HEPIS影响细胞周期的途径。结果1筛选结果显示HEPIS显著下调NF-κB的活性。2生物信息学分析显示:HEPIS全长666bp,CDS区444bp,可编码出一个147个氨基酸蛋白质,无跨膜结构,无信号肽,定位在细胞核,与其他物种同源性较低,是人类进化较特异的基因。3 RT-PCR实验表明HEPIS广泛表达于人类细胞系中。4将HEPISp EGFPN1和HEPIS-p EGFPC3分别转染入293T细胞,荧光显微镜下观察融合的绿色荧光蛋白在细胞内位置,结果表明其定位于胞质。5以空载p CMVSPORT6载体质粒为对照,分别转染过表达HEPIS基因的质粒和转染干扰HEPIS基因表达的si RNA沉默子,通过在293T细胞系中24小时后观察细胞形态和在A498细胞系中15天克隆形成计数发现HEPIS有抑制细胞增殖作用。6在肾细胞系293T和肾癌细胞系A498中,应用CCK8试剂盒连续检测细胞增殖,发现过表达HEPIS组细胞增殖显著下降,沉默HEPIS组细胞增殖显著增强。7转染24小时后,FCM检测细胞周期,分析得知过表达HEPIS基因的细胞,其S期明显高于对照组,沉默该基因产生相反作用。结果提示HEPIS可能通过阻滞S/G2期抑制细胞增殖。结论1 HEPIS是一个可以显著下调NF-κB通路活性,定位于细胞质,在人体内普遍表达,进化中与其它物种差异较大的基因。2分别过表达和干扰HEPIS可以显著下调和上调293T和A498细胞的增殖。3 HEPIS可能通过阻滞细胞S/G2期间转换来抑制细胞增殖。