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高迁移率族蛋白（HMG）基因普遍存在于脊椎动物中，包括哺乳动物，鸟类，两栖类和鱼类。HMGB家族蛋白是一个高度保守的DNA结合蛋白，在维持核小体结构，转录，炎症和细胞增殖中发挥重要作用。七鳃鳗被认为是现有的无颌脊椎动物中最理想的模式生物，而对七鳃鳗免疫结构的演变和发展的研究有助于更好地了解脊椎动物进化历程。目前为止对HMG家族基因的研究主要集中在哺乳动物中的HMGB基因，而关于七鳃鳗HMGB的研究甚少。为了阐明原始脊椎动物中HMGB基因的分子系统发育，本实验从七鳃鳗的类淋巴细胞cDNA文库中发现了三个与高等脊椎动物HMGB同源的EST序列，并克隆了3个HMGB基因，命名为Lj-HMGB1，Lj-HMGB2和Lj-HMGBX。Lj-HMGB1、Lj-HMGB2和Lj-HMGBX的开放阅读框的长度分别为627bp、585bp和678bp，并且各自编码208，194和225个氨基酸。通过生物信息学分析计算出Lj-HMGB1、Lj-HMGB2和Lj-HMGBX的分子量分别为24086道尔顿，22177道尔顿和25271道尔顿。结构域分析表明，这三个高迁移率族蛋白氨基酸序列包含了四个结构域：HMG-boxA，HMG-box B，C端酸性尾和一个连接子。进化分析揭示，七鳃鳗HMGB基因位于脊椎动物HMGB家族基因进化的外群，Lj-HMGBX进化时间早于Lj-HMGB1和Lj-HMGB2，应是HMGB家族基因的祖先。这一发现意味着，在七鳃鳗中已经具有基因间复制现象，进而产生HMGB1、HMGB2和HMGBX基因，这种分歧发生在头索动物亚门和尾索动物亚门之后，至少在4亿5千万年前。通过RT-PCR检测，在七鳃鳗大部分的组织中如白细胞、肾脏、心脏、肝脏、鳃、肠、性腺、肌肉和口腔腺中都检测出了Lj-HMGB1、Lj-HMGB2和Lj-HMGBX的表达，只是Lj-HMGB2基因在口腔腺中表达量很少。此外，Lj-HMGB1在大多数组织中的表达水平高于Lj-HMGB2和Lj-HMGBX。这个发现不仅证实了七鳃鳗这个无颌类脊椎动物中已经具有基因间复制现象，而且为研究HMGB家族在无脊椎动物和脊椎动物的进化起源分析方面提供资料。通过实时定量PCR法检测LPS和ConA免疫后七鳃鳗类淋巴细胞，肾脏，心脏，鳃，肠组织中Lj-HMGB1基因的表达量变化。Lj-HMGB1在未经免疫的心脏中高水平表达，但在LPS和ConA免疫后，只有鳃组织中HMGB1的表达量显著上调。将七鳃鳗HMGB1基因构建到原核表达载体pET28a上，经IPTG诱导表达出融合蛋白。纯化的rLj-HMGB1蛋白分子量约27KDa，在浓度12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上形成单独的条带。将纯化的rLj-HMGB1作为抗原，制备了兔抗Lj-HMGB1的多克隆抗体。蛋白印迹实验表明，兔抗Lj-HMGB1抗体既识别重组表达的蛋白，也特异性识别七鳃鳗心脏，肾脏，鳃，肠和类淋巴细胞中天然的HMGB1蛋白。为了研究七鳃鳗HMGB1的生物学功能，首先检测HMGB1蛋白与DNA的结合能力，纯化的rLj-HMGB1通过与七鳃鳗GAPDH的多聚核苷酸（101bp和12bp）反应，采用凝胶电泳迁移实验（EMSAs）分析发现重组人HMGB1蛋白和重组七鳃鳗HMGB1都可以使DNA泳动速度减慢，并呈剂量依赖关系，并且验证rLj-HMGB1蛋白可以保护pEGFP-N1质粒DNA免遭DNaseI降解。通过ELISA实验发现，rLj-HMGB1可促进THP-1单核细胞释放TNF-α，在培养24小时后分泌的TNF-α量达到最高。之后，TNF-α水平开始下降，并在48小时降到最高值的50％。用重组人HMGB1蛋白和LPS作为阳性对照，发现也都可以诱导THP-1细胞释放TNF-α产生。为了排除大肠杆菌中内毒素导致TNF-α释放，加入了阴性对照His-标签蛋白（Lj-HBP1），发现Lj-HBP1蛋白没有导致TNF-α的释放。这些实验结果表明，rLj-HMGB1可诱导THP-1单核细胞释放炎性细胞因子。为了确定rLj-HMGB1是否可诱导肿瘤细胞的扩散，将人乳腺腺癌细胞（MCF-7）与rLj-HMGB1培养24小时，通过MTT实验发现rLj-HMGB1可促进MCF-7细胞增殖，并呈剂量依赖性增加。总之，本实验室已经从七鳃鳗的类淋巴细胞中克隆出三条与人同源的HMGB基因。重组Lj-HMGB1蛋白可与双链DNA结合，并保护DNA免遭DNaseI水解。Lj-HMGB1蛋白可诱导人乳腺癌细胞扩散增殖。进一步实验发现，Lj-HMGB1能够诱导人THP1细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。这些结果表明，七鳃鳗可能使用HMGB1蛋白激活先天免疫机制进而防御病原体对机体的损伤。