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骨缺损修复是目前临床最常见的,同时也是最棘手的问题之一,至今没有找到理想而又可靠的治疗方法。自体骨移植和异体骨移植都有诸多无法克服的缺点。为此,化学合成理想的多聚物来代替骨移植成为近年的研究热点。化学合成的多聚物已经在临床上广泛的使用。然而多聚物较低的骨引导性和缺乏骨诱导性的弱点限制了它们在临床上大面积骨缺损修复方面的应用。目前,提高骨引导性能主要是通过引入涂层来实现的。然而许多涂层制备方法都需要用到有机溶剂,而可能残留的有机溶剂会损害细胞的成骨潜能。直接将陶瓷颗粒预先加入多聚物内部的方法会降低生物活性陶瓷与成骨细胞相互接触的机会。现有的仿生矿化方法需要多聚物表面具有活性基团才能形成涂层。表面吸收引入骨生长因子如骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是目前赋予多聚物骨诱导性的主要方法。然而表面吸附的蛋白暴露于生理条件下会表现出快速的、短暂的释放,而无法维持诱导成骨的微环境。提高骨生长因子剂量或增大载体的表面积等方法都存在相应的不足。本研究采用两段式钙磷矿化法来实现在模拟生理的环境下在多聚物表面制备涂层,用以提高多聚物的骨引导性,并将其作为载体实现骨形成蛋白的缓慢释放,从而维持骨生成的微环境,实现持续地诱导骨组织再生。第一部分Polyactive、Ethicon、PLGA的三维结构、表面化学性状对仿生钙磷涂层理化性质的影响本实验旨在明确多聚物的三维结构、表面化学性状等因素对仿生钙磷涂层的形态、特征基团、化学成分等理化性质的影响。材料与方法实验选取polyactive,ethicon,PLGA三种多聚物,以collagen作为对照载体材料。采用两段式涂层制备方法:第一段,通过浸润在5倍模拟体液内在多聚物表面制备种子层;第二段,通过浸润在超饱和钙磷溶液中在种子层的基础上制备蛋白携带层。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)检测四种载体材料的大体形态、表面结构以及涂层的形态结构。通过傅立叶红外衍射分析(fouriertransforminfrared spectroscopy,FTIR)来分析四种载体及涂层的主要的化学基团。通过与扫描电镜相连的能量弥散X线(engergy dispersive X-ray analysis,EDAX)分析来测量涂层的钙磷元素比值。通过X线衍射分析(X—ray dispersiveanalysis)来鉴定钙磷涂层的化学成分。结果SEM结果显示四种载体材料(三种多聚物和collagen)的三维结构均不相同,Polyactive和collagen呈多孔状,而Ethicon和PLGA呈纤维状。但在这四种载体材料表面所制备的种子层(无定形空球状)和蛋白携带层(晶体)的形态相同。FTIR结果显示四种载体材料的表面化学基团各不相同,特征峰的形态及位置各异。但在其表面所形成涂层的化学基团的特征峰及位置相同。EDAX结果显示涂层钙磷比随着超饱和钙磷溶液体积的变化而变化。XRD结构表明:种子携带层的化学成分为无定形的磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP),蛋白携带层的化学成分为低钙的羟基磷灰石(calcium deficient hydroxyapatite,CDHA)。结论1.两段式仿生生物矿化的方法能够在多聚物表面形成均一的钙磷涂层。2.在不同多聚物载体上制备的钙磷涂层具有相同的形态和化学组成。第二部分蛋白与仿生钙磷涂层在多聚物表面的共沉积及其控制释放材料与方法在制备蛋白携带层过程中,加入牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作为蛋白样品与涂层发生共沉积。所制备的样品通过傅立叶红外衍射分析(FTIR)分析蛋白的引入对于涂层化学组成的影响。采用标记与牛血清白蛋白相连的异硫氰氨酸荧光素(Fluoresceine isothiocyanate,FITC)的作为蛋白标记物检测与涂层共沉积的蛋白的体外释放曲线。采用双荧光标记的方法:用罗丹明标记种子层,用FITC-BSA标记蛋白携带层,通过激光共聚焦显微镜(Laser confocal scanning microscopy,LCSM)来检测两段式涂层微观排列及共沉积蛋白在涂层内的分布。结果涂层与蛋白共沉积后,涂层本身的特征峰位置未发现明显的位移。在蛋白酰胺Ⅰ带所在的位置,涂层的特征峰与蛋白酰胺Ⅰ带峰值发生重叠并向高位迁移,这种现象在四种载体材料上均有体现。与涂层共沉积的蛋白在可在体外持续释放35天以上。四种载体材料的蛋白释放曲线的模式相同,均包括初期的快速释放和后期的缓慢释放。快速释放的速率与载体材料的三维结构有关,纤维型多聚物的蛋白的释放速率比多孔型多聚物低。后期缓慢释放的速率与涂层溶解有关,在四种载体材料上所表现的速率相同。激光共聚焦显微镜下观察显示两段式涂层沿着多聚物表面形成双层结构。蛋白在蛋白携带层内均匀分布,而并非是通过吸收的方式进入多聚物内部。结论1.蛋白能够与涂层共沉积在多聚体表面形成复合物。2.仿生涂层能够实现与其共沉积的蛋白持续地控制释放,时间长达5周以上。3.四种不同载体表面与涂层共沉积蛋白的释放曲线模式相同。第三部分Polyact ive、Ethicon、PLGA的BMP-2沉积仿生钙磷涂层在大鼠皮下异位成骨作用材料与方法实验通过在无菌条件下与涂层共沉积的骨形成蛋白-2赋予多聚物骨诱导性。所携带的BMP-2的量通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)进行测量。设立载体+涂层、单纯载体、载体+吸附BMP-2三个对照组。将制备的样品植入大鼠皮下异位成骨模型中。5周取出,后经过固定、脱水、二甲基丙烯酸酯(methyl methacrylate,MMA)包埋、硬组织切片,随机系统采样,三维立体形态学(stereology)分析等,检测新生骨组织的体积、分布。制备有涂层的样品也进行包埋,切片,随机系统采样,三维立体形态学分析等方法,作为0时间点样品名,分析多聚物表面密度等指标。结果在载体+涂层+共沉积BMP-2组和载体+吸附BMP-2组内有新骨形成,在单纯载体组和载体+涂层组无新骨形成。对于每一种载体,在载体+涂层+共沉积BMP-2组的新生骨总量高于载体+吸附BMP-2组。载体+涂层+共沉积BMP-2组的BMP-2诱导骨生成效能高于或显著高于载体+吸附BMP-2组。载体+涂层+共沉积BMP-2组的新骨密度与0时间点多聚物表面积密度成正比。结论1.在四种载体上,与涂层共沉积的BMP-2能够保持其生物活性,在大鼠皮下异位成骨模型中诱导新骨形成。2.涂层共沉积BMP-2的诱导成骨效能高于载体表面单纯吸附的BMP-2,而且这种成骨效能具有非BMP-2剂量依赖性。3.诱导成骨功能化多聚物在0时间点的表面积密度是其诱导成骨活动的主要调节因素。第四部分BMP-2沉积仿生钙磷涂层对Polyactive、Ethicon、PLGA生物降解性和生物相容性的影响材料与方法大鼠皮下异位成骨模型中,采用三维立体形态学(stereology)的分析方法,通过分析外体巨细胞的体积来检测BMP-2共沉积仿生钙磷涂层对多聚物生物相容性的影响。通过分析残留多聚物的实体体积来分析BMP-2共沉积仿生钙磷涂层生物降解性的影响。观察脂肪组织的分布及体积来分析与涂层共沉积的BMP-2诱导成骨过程中脂肪组织的生长及分布状况。分析软组织囊下组织总体积等指标来全面评价功能化多聚物的生物功能性。结果Polyactive各组在大鼠皮下种植5周后残留多聚物的体积与0时间点无明显差异。Collagen、PLGA、Ethicon各组中,载体+涂层组的残留多聚物体积最高,单纯载体组和载体+吸附BMP-2组相似:与载体+涂层组相比,载体+涂层+共沉积BMP-2组的残留多聚物体积降低或显著降低。载体+涂层+共沉积BMP-2组的软组织囊下总体积高于其它三个对照组。除了collagen两个无残留组,外体巨细胞体积密度在载体+涂层组最高,在载体+涂层+共沉积BMP-2组最低。新生的脂肪组织伴随着新生骨组织生长,在载体+涂层+共沉积BMP-2有大量新骨生成的组,新生脂肪组织体积显著高于无骨生成的单纯多聚物组和多聚物+涂层组。结论1.载体的生物降解是多种因素综合作用的结果。多聚物本身的生物降解性是决定性因素,在此基础之上,共沉积的BMP-2能够促进多聚物的生物降解,而涂层本身对多聚物起保护作用。2.BMP-2共沉积仿生涂层诱导成骨功能化能够通过降低外体巨细胞反应,营造有利的成骨环境。