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目的:宫颈癌为全球范围内威胁女性健康的第四大恶性肿瘤,是女性因恶性肿瘤死亡的首要原因。虽然宫颈癌的筛查较其他肿瘤更加容易,但宫颈癌的治疗成本极高,因为其根治性手术需要行宫颈广泛性切除术,同时清除盆腔淋巴结,因此手术创伤大、风险高、术后并发症多、恢复时间长、预后差。有些患者因病理类型或期别较晚、手术效果不满意等,术后仍经常需要补充放射性治疗或化疗,生存质量因此严重降低。因此,针对宫颈癌发生的机制的研究尤为重要。因为明确发病机制后,针对宫颈癌的发病进行阻断,将大大降低治疗成本,提升生活质量。2008年德国科学家哈拉尔德·楚尔·豪森发现人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染导致宫颈癌的发生并因此获得诺贝尔医学奖。而后大量研究表明,HPV感染与人类多种疾病相关,尤其是高危型HPV的持续感染与恶性肿瘤的发生密切相关,而宫颈癌占此类恶性肿瘤的比例较大。目前已经发现HPV是一种环状双链DNA病毒。HPV16是导致宫颈癌发生的最常见的类型,约占宫颈癌总发病率的70%以上。HPV16中的E6和E7蛋白是宫颈癌发生发展中的最主要致癌基因,前期研究发现,E6蛋白主要通过抑制p53基因抑制细胞的凋亡,而E7蛋白主要通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白（p Rb）促进细胞的增殖。Warburg效应提出,肿瘤细胞与正常细胞比较,即使在有氧的条件下也通过糖酵解方式获取能量,而因此消耗更多的葡萄糖。而目前为止,将HPV感染与糖酵解途径相结合的研究并不多,同时,HPV16中的E6、E7蛋白影响宫颈癌细胞葡萄糖摄取的分子机制目前也尚未见报道。因此,尽管E6和E7蛋白的致癌作用已经确立,但是其与宫颈癌发生发展的机制研究仍处于起步阶段,尤其是E6和E7蛋白对有氧糖酵解途径的调控还尚存许多空白。由此可见,深入研究HPV16感染在宫颈癌发生中的分子机制,对宫颈癌的防控及早期治疗具有深远意义和实用价值。研究方法:1、在C-33A细胞（HPV阴性）中分别转染E6、E7蛋白,然后应用Western blot技术和qRT-PCR技术分别在蛋白水平和RNA水平检测E6、E7及下游LKB1、PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,明确其上下游关系及调控关系。在Si Ha细胞（HPV16阳性）中分别干扰E6、E7蛋白,应用Western blot技术和qRT-PCR技术分别在蛋白水平和RNA水平检测E6、E7及下游LKB1、PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,反向验证上述各基因的调控关系。2、在C-33A细胞中干扰LKB1,应用Western blot和qRT-PCR分别检测LKB1及下游PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,明确其调控关系。在Si Ha细胞中转染LKB1,应用Western blot和qRT-PCR分别检测LKB1及下游PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,反向验证各基因的调控关系。3、在Si Ha细胞中干扰PKM2,应用Western blot和qRT-PCR检测PKM2及下游p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,明确其调控关系。在Si Ha细胞中干扰PKM2,应用核浆分离技术和Western blot分别检测细胞核和细胞浆中p65及p-p65的蛋白表达变化,明确p65致癌活性的影响因素。在Si Ha细胞中干扰PKM2,应用免疫荧光技术,验证p65致癌活性的影响因素。4、在Si Ha细胞中干扰p65,应用Western blot和qRT-PCR检测p65及下游HIF-1α和GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,明确各基因的调控关系。在Si Ha细胞中干扰p65,应用核浆分离技术和Western blot分别检测细胞核和细胞浆中HIF-1α的蛋白表达变化,明确HIF-1α活化时的亚细胞定位。在Si Ha细胞中干扰p65,应用葡萄糖吸收实验检测葡萄糖吸收变化,验证p65对宫颈癌细胞葡萄糖吸收的影响。5、在Si Ha细胞中干扰HIF-1α,应用Western blot和qRT-PCR检测HIF-1α及下游GLUT1的蛋白和mRNA表达变化,明确各基因的调控关系。在Si Ha细胞中干扰HIF-1α,应用葡萄糖吸收实验检测葡萄糖吸收变化,验证HIF-1α对宫颈癌细胞葡萄糖吸收的影响。6、利用SPSS软件对本实验的所有数据进行统计分析,各组数据均采用双尾t检验。结果:1、Western blot和qRT-PCR结果显示,E6、E7蛋白均抑制LKB1蛋白和mRNA的表达,促进PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达。2、Western blot和qRT-PCR结果显示,LKB1抑制PKM2、p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达。3、Western blot和qRT-PCR结果显示,PKM2促进p65、HIF-1α及GLUT1的蛋白和mRNA表达。核浆分离技术和Western blot结果显示,细胞核内p65的蛋白表达变化不明显,细胞浆中p65的蛋白表达水平变化不明显,细胞核内p-p65的蛋白表达水平明显降低,细胞浆中p-p65的蛋白表达水平明显升高,提示p65致癌活性的影响因素为磷酸化水平及定位于细胞核内。免疫荧光实验显示干扰PKM2细胞核内p-p65荧光值降低,验证了p65致癌活性的影响因素为磷酸化水平及定位于细胞核内。4、Western blot和qRT-PCR结果显示,p65促进HIF-1α和GLUT1的蛋白和mRNA表达。核浆分离技术和Western blot结果显示,细胞核内HIF-1α的蛋白表达水平降低,细胞浆中HIF-1α的蛋白表达水平升高,提示p65促进HIF-1α的核内蓄积。葡萄糖吸收实验显示干扰p65后,细胞葡萄糖吸收减少。5、Western blot和qRT-PCR结果显示,HIF-1α促进GLUT1的蛋白和mRNA表达。葡萄糖吸收实验显示干扰HIF-1α后,细胞葡萄糖吸收减少。结论:1、E6和E7与LKB1、PKM2、p65、HIF-1α、GLUT1为上下游调控关系,HPV16感染导致了宫颈癌细胞葡萄糖吸收增加,促进了肿瘤进展。2、p65的致癌活性由磷酸化水平及细胞核内定位二者共同决定。3、HIF-1α的致癌活性由HIF-1α在核内的蓄积程度决定。4、GLUT1的转运活性决定了宫颈癌细胞葡萄糖吸收的能力,代表着肿瘤发展潜能。