第一部分突变p 5 3通过Egr-l/p300介导电离辐射诱导Cathepsin L表达　　目的：阐明p 5 3基因突变对电离辐射诱导Cathepsin L 的意义，研究Egr-l/p300与突变p 5 3之间的关系，证实在电离辐射作用下E g r-l/p 3 0 0是突变p 5 3上调Cathepsin L 的重要靶点，阐明Cathepsin L 是突变p 5 3功能获得的重要参与者。　　方法：Western b l o t检测10 G y电离辐射对不同p 5 3状态的肿瘤细胞的Cathepsin L、Egr-1、p300表达水平的影响；荧光素酶报告基因检测法观察电离辐射对Cathepsin L 启动子p53结合区域的活性的影响；染色质免疫沉淀法检测不同状态p53的肿瘤细胞中的p53、p300与Cathepsin L 启动子在电离辐射后的结合情况;使用Egr-1或p300干扰R N A处理肿瘤细胞后进行辖照并通过western b lo t检测细胞中的Cathepsin L表达情况，以及通过荧光素酶报告基因检测法观察干扰R N A对Cathepsin L 启动子p53结合区域的活性的影响，通过染色质免疫沉淀法检测干扰p300对突变p 5 3与Cathepsin L 启动子之间结合的影响；使用结肠癌细胞株HT-29 ( p 5 3突变型）和R K 0 (p53野生型）建立裸小鼠皮下移植瘤模型，并对肿瘤部位进行20 G y剂量的X 射线照射，运用western b lo t、免疫组化分析法检测不同p 5 3状态肿瘤细胞皮下移植瘤中的Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0的表达情况。收集结肠癌和乳腺癌临床病例样本，western b l o t法检测Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0在样本中的表达水平，对组织样本进行p 5 3基因突变检测，免疫组织化学染色法观察Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0在野生和突变p53肠癌组织中的表达情况。　　结果：电离辐射处理后，western b lo t实验结果显示p53-R273H基因突变的肿瘤细胞U251、HT-29和MDA-MB-468 内的Cathepsin L、Egr-1和p300表达均上调，而p53野生型肿瘤细胞U87、R K 0和MCF-7内的相应蛋白表达水平在电离辐射前后没有明显差异；荧光素酶报告基因检测结果显示电离辐射诱导P53基因突变的肿瘤细胞Cathepsin L 启动子p 5 3结合区域活性增加;染色质免疫沉淀检测结果显示肿瘤细胞受到电离辐射的情况下，突变型p 5 3与Cathepsin L 的启动子结合增强；E g r-1和p300干扰R N A能够有效的抑制电离辐射对Cathepsin L 的上调，染色质免疫沉淀检测结果显示Cathepsin L 的转录过程也依赖于p 3 0 0与Cathepsin L 启动子的结合，干扰p300能够抑制突变p53和CathepsinL启动子的结合。另外，在裸小鼠皮下移植瘤模型中，突变组的放疗效果没有野生组理想；免疫组化分析显示，相较于野生组细胞株，突变组细胞株移植瘤中的Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0表达均受到电离辐射诱导增加，与细胞实验结果是一致的。在临床结肠癌样本中，与对应的正常癌旁组织相比, Cathepsin L和E g r-1均高表达于癌组织中，乳腺癌组织样本中的Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0也均高于癌旁组织。另外，p53突变检测结果显示结肠癌样本中有两例的p53突变发生在2 7 3位点，相应样本的免疫组织化学染色结果显示Cathepsin L、E g r-1和p 3 0 0均高于癌旁组织，并且Cathepsin L有明显的核转位现象，而p 5 3野生型样本组织中的Cathepsin L核转位现象没有突变样本明显。　　结论：电离辐射作用下，突变p 5 3能通过诱导转录因子E g r-l/p 3 0 0调控Cathepsin L 的表达。　　第二部分突变p 5 3细胞的Cathepsin L启动子甲基化状态对电离福射诱导Cathepsin L转录激活的影响　　目的：阐明突变p 5 3通过影响Cathepsin L 启动子甲基化介导电离辐射诱导的后者的转录激活机制，揭示表观遗传学机制在Cathepsin L基因转录调控中的表现。　　方法：电离辐射处理不同p 5 3状态的肿瘤细胞后, western b l o t检测细胞中甲基化转移酶Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b的表达情况，并提取细胞总DNA, 通过甲基化特异性PCR ( M S P )检测Cathepsin L 启动子p 5 3结合位点上游区域的甲基化水平，采用重亚硫酸盐测序PCR ( B S P )检测Cathepsin L 启动子p 5 3结合位点上游区域甲基化位点的具体变化。　　结果：western b l o t结果显示电离辐射上调了 p 5 3突变型细胞的甲基化转移酶Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b的表达水平，甲基化特异性PCR结果显示电离辐射提高了P53-R273H位点突变的胶质瘤细胞U251和肠癌细胞HT-29内的Cathepsin L 启动子上 p53结合区域上游甲基化水平。进一步利用重亚硫酸盐测序PCR结果显示，P53突变型细胞U251、HT-29的Cathepsin L 启动子甲基化水平均高于U87细胞，并且，电离辐射对p 5 3突变型肿瘤细胞U 2 5 1内Cathepsin L启动子上p 5 3结合区域上游甲基化水平增加了 7%，HT-29细胞增加了 5%，而p53野生型胶质瘤细胞U87和肠癌细胞RKO的相应区域甲基化水平辐照前后无明显差异。　　结论：静态水平下p 5 3突变型细胞Cathepsin L低水平表达与其启动子髙甲基化水平相关，电离辐射进一步上调p 5 3突变型肿瘤细胞Cathepsin L 的启动子甲基化水平，因此，电离辐射诱导的突变p 5 3细胞Cathepsin L 的表达可能与其启动子甲基化没有相关性。