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目的:聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly-ADP-ribose polymerase,PARP）抑制剂奥拉帕尼（olaparib）是最早获得FDA批准并广泛用于卵巢癌治疗的PARP抑制剂,在存在同源重组缺陷的患者中,olaparib可由于造成合成致死而发挥更好的效果。但是,约70%的卵巢癌患者并不存在同源重组缺陷,因而严重限制了olaparib的临床应用。本课题组前期研究结果显示,PTEN（Phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10）抑制剂VO-OHpic可通过促进DNA双链断裂,增强卵巢癌细胞对olaparib的敏感性,但其具体的分子机制尚不清楚。因此,本课题主旨是探索VO-OHpic对卵巢癌细胞发挥杀伤作用的内在机制,以揭示其如何增强卵巢癌细胞对olaparib的敏感性。方法:我们首先通过GEPIA数据库分析与DNA双链损伤修复相关的同源重组修复通路的关键基因与PTEN的表达相关性、Kaplan-Meier plotter网站分析关键基因与卵巢癌患者预后的相关性以及ualcan数据库分析关键蛋白在卵巢癌中的差异表达,初步筛选了三个PTEN在细胞核中发挥作用的可能靶点。随后,利用q RT-PCR、Western blot和免疫荧光试验检测VO-OHpic对三个可能靶点的m RNA水平、蛋白表达及细胞核内表达水平的影响。然后,采用Western blot和免疫荧光检测VO-OHpic对卵巢癌细胞中PTEN蛋白的表达量及细胞核中PTEN蛋白的表达量影响,寻找与PTEN对靶基因发挥调控作用有关的关键分子并探索其发挥作用的可能机制。最后,为排除VO-OHpic作为小分子抑制剂可能产生的脱靶效应,我们构建了三种靶向PTEN的慢病毒敲减载体shPTEN-1,shPTEN-2和shPTEN-3,使用q RTPCR和Western blot检测PTEN敲减效果;使用MTT、流式和Western blot检测PTEN敲减后卵巢癌细胞的增殖、周期及凋亡的变化,以及三个可能靶点的表达变化。结果:采用GEPIA数据库对TCGA以及GTEx数据集的卵巢癌样本进行基因表达相关性分析的结果显示,同源重组修复通路中22个关键基因的m RNA水平与PTEN基因具有显著相关性,其中相关性最强的基因包括RAD54B、TOPBP1、RAD50、MRE11、TOP3和NBN。在这六个基因中,MRE11、RAD50和NBN的蛋白产物可形成MRN复合物,在DNA损伤修复、特别是DNA双链损伤修复中发挥至关重要的作用。采用Kaplan-Meier plotter网站对MRE11、RAD50和NBN与卵巢癌患者生存期相关性分析的结果显示,这三个基因高表达的卵巢癌患者预后不良,并且同时对这三个基因进行分析,也得到了类似的结果。采用ualcan数据库对CPTAC蛋白质组数据集中卵巢癌样本分析的结果显示,MRE11,RAD50和NBN蛋白在卵巢癌样本中的表达显著升高。随后的q RT-PCR和Western blot结果显示,VOOHpic可显著降低卵巢癌细胞中MRE11、RAD50和NBN三个基因的m RNA和蛋白水平。免疫荧光结果显示,在卵巢癌细胞核中,DNA损伤诱导剂doxorubicin处理可使MRN复合物相关三个蛋白的表达量显著增加;而VO-OHpic可显著增强doxorubicin造成的DNA损伤,并显著降低了MRE11、RAD50和NBN蛋白的表达。在探索PTEN对MRN复合物相关蛋白表达调控的关键分子时,我们首先采用Western blot检测发现,在卵巢癌细胞中,VOOHpic处理显著降低PTEN蛋白的表达量及细胞核中PTEN蛋白的表达量。随后通过文献检索及采用the Signaling Pathways Project数据库分析,发现E2F1可能与PTEN对MRN复合物相关蛋白表达的调控有关。免疫荧光检测结果显示,在卵巢癌细胞中,doxorubicin可使细胞核中PTEN和E2F1的表达增加,而额外添加VO-OHpic则显著降低这两种蛋白在细胞核中的表达;且这两种蛋白不论在doxorubicin处理下还是doxorubicin与VO-OHpic联合处理时,在细胞核中均存在很强的共定位,因此E2F1可能是卵巢癌细胞核中PTEN对MRN复合物表达调控的关键分子。此外,为了排除小分子抑制剂可能存在的脱靶效应,我们构建了三种靶向PTEN的慢病毒敲减载体shPTEN-1,shPTEN-2和shPTEN-3。q RT-PCR和Western blot结果表明,在卵巢癌细胞中,shPTEN慢病毒可显著降低PTEN的表达。MTT、流式及Western blot结果显示,shPTEN可抑制细胞的增殖和周期、促进细胞凋亡;降低细胞中MRN复合物相关蛋白MRE11、RAD50和NBN的表达;并增强卵巢癌细胞对olaparib的敏感性。结论:VO-OHpic可通过抑制卵巢癌细胞核内PTEN的表达,降低PTEN-E2F1相互作用,进而阻碍MRN复合物相关蛋白MRE11、RAD50、NBN的表达,并因此抑制细胞核内的同源重组修复通路而造成同源重组缺陷,使得DNA双链断裂累积,最终抑制细胞增殖及肿瘤生长,并因此可与olaparib联用,增强卵巢癌细胞对olaparib的敏感性。该结果提示在临床上应用PTEN抑制剂,可增强PARP抑制剂在同源重组缺陷阴性的卵巢癌患者中的治疗效果。因此,PTEN抑制剂单用或者与PARP抑制剂联用可能成为控制卵巢癌患者体内肿瘤生长的治疗手段。