研究背景：宫颈癌是妇女常见的生殖道恶性肿瘤，全球每年约有49万新诊断宫颈癌病例，死于宫颈癌的患者超过27万，其中80％来自发展中国家。近年来，随着宫颈癌普查的广泛开展，发达国家宫颈癌发病率已大幅度下降，但在发展中国家，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌位列女性恶性肿瘤的第2位。宫颈癌的发病机制至今还不十分清楚，研究发现宫颈癌组织中多个原癌基因和抑癌基因表达失常，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是诱导宫颈上皮细胞恶性转化的关键因素。 HPV是世界范围内最常见的性传播感染因子，有120多种亚型，其中15种亚型有致癌性。依据宫颈癌致瘤性的高低，HPV分为高致病性和低致病性两类。其中HPV16和HPV18致瘤性较强，HPV16感染与宫颈鳞癌发病有关，HPV18感染与宫颈腺癌发病有关。HPV属微小无包膜的环状双链DNA病毒，共编码8个基因，其中E6和E7基因编码的蛋白称为病毒原癌蛋白，是HPV介导宫颈癌发生的重要分子。E6蛋白引起的p53降解与E7蛋白引起的pRb功能丧失，是E6和E7癌蛋白干扰细胞周期负调控功能的重要机制，诱导细胞进入S期，从而使细胞绕过正常细胞周期调控监测点，细胞增殖失控，发生恶性转化，但高危型HPV引起宫颈上皮细胞多个原癌基因和抑癌基因表达异常的分子机制尚未完全阐明。microRNAs(miRNAs)在恶性肿瘤发生中作用的研究为阐明高危型HPV致瘤的分子机制开拓了新方向。 MicroRNA(miRNA)是19～24个核苷酸(nt)长度的单链RNA分子，是内源性、不编码蛋白的短小RNA，在基因表达调控方面发挥重要作用。miRNA基因首先由RNAPolymeraseⅡ转录产生几百甚至几千nt的初级产物，在核内被RnaseⅢ内切酶家族中的Drosha酶切割成70个nt左右的发夹状前体(pre-miRNA)，pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出核。在细胞浆中，pre-miRNA经Dicer酶切割成约19～24个nt的双链miRNA。其中一条RNA链进入核蛋白复合体，形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，这条单链RNA称为成熟miRNA，而别一条RNA单链则被降解。RISC引导miRNA与互补的mRNA形成完全或不完全的配对，降解mRNA或阻遏其转录后翻译，产生基因沉默。人类基因组中约有1000多个miRNA基因，每个miRNA可调节200多个靶基因，因此约三分之一编码蛋白基因受miRNA调控。 miRNAs参与了动植物多种生命过程，包括增殖、凋亡、发育、分化和代谢等。miRNAs表达异常与病毒感染关系密切，参与了病毒的致病过程，同时有证据显示miRNAs参与了恶性肿瘤的发生。对基因组中肿瘤相关基因区域序列分析时发现，有52.5％的miRNA基因位于其附近。多种肿瘤组织中发现miRNAs表达异常，形成了不同肿瘤的miRNA表达谱。有学者认为在肿瘤组织中低表达的miRNA本身可能就是癌基因，而在肿瘤组织中高表达的miRNA本身可能就是抑癌基因，miRNA在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。目前，关于miRNAs在高危型HPV诱导宫颈上皮细胞恶性转化过程中的作用还不明确，有必要进一步探讨。 研究目的： (1)筛选HPV阳性宫颈腺癌组织特异的miRNA表达谱； (2)调控HPV阳性宫颈腺癌组织特异表达miRNA，探讨其对宫颈腺癌细胞生物学行为的作用； (3)调控HPV阳性宫颈腺癌组织特异表达miRNA，探讨其对宫颈腺癌细胞基因表达的影响。 研究方法： (1)应用miRNA芯片检测11例HPV阳性宫颈腺癌组织和癌旁组织miRNAs表达，筛选HPV阳性宫颈腺癌组织特异表达的miRNAs，并应用定量PCR方法进行验证； (2)应用Ambion公司调控miRNA表达的系列试剂，上调HeLa细胞miR-99b表达； (3)应用MTT法检测miR-99b表达上调的HeLa细胞增殖率的变化； (4)应用流式细胞仪检测miR-99b表达上调的HeLa细胞凋亡率和细胞周期分布的变化； (5)应用软琼脂克隆形成实验检测miR-99b表达上调的HeLa细胞集落形成率的变化； (6)应用体外侵袭实验检测miR-99b表达上调的HeLa细胞穿透微孔滤膜数量的变化； (7)应用裸鼠移植瘤模型检测miR-99b表达上调的HeLa细胞成瘤性和移植瘤微血管密度的变化； (8)应用人基因组芯片检测miR-99b表达上调的HeLa细胞基因表达的变化，并应用RT-PCR方法进行验证。 研究结果： (1)HPV阳性宫颈腺癌组织共有15条miRNA基因表达发生变化，其中上调表达的11个，下调表达的4个，定量PCR检测结果验证了miRNA芯片结果； (2)miR-99b表达上调的HeLa细胞增殖率降低； (3)miR-99b表达上调的HeLa细胞凋亡率增加，处于G0/G1期细胞数量增加，S期细胞数量减少； (4)miR-99b表达上调的HeLa细胞集落形成率和集落中细胞数量减少； (5)miR-99b上调表达的HeLa细胞穿透微孔滤膜的细胞数量无明显变化； (6)miR-99b表达上调的HeLa细胞移植瘤生长减慢，移植瘤微血管形成减少； (7)miR-99b表达上调的HeLa细胞，共有69个基因表达发生变化，其中上调表达的有43条，下调表达的有26条。 研究结论： (1)HPV阳性宫颈腺癌组织存在miRNAs特异表达谱； (2)HPV阳性宫颈腺癌组织中表达下调的miR-99b，参与了HPV诱导宫颈腺上皮细胞恶性转化过程。