一、研究背景与目的肝纤维化是许多慢性肝脏疾病的共同病理基础,主要以细胞外基质(尤其是纤维胶原)的过度沉积为特征,是机体对各种病因引起慢性肝损伤后的一种损伤修复的动态过程。常见病因包括：慢性炎症、病毒性和自身免疫性肝炎、酒精性肝病、代谢性肝病、胆汁淤积和铁沉积等。肝纤维化如果不能得到及时治疗将会进展为肝硬化甚至肝细胞肝癌,并会出现一系列并发症如食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水、肝肾综合征等,给患者带来巨大的痛苦甚至威胁生命。尽管近年来肝纤维化的机制研究已经取得了巨大的进展,但临床上有效的治疗手段仍较欠缺。在受损的肝脏中,活化的肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSCs)是分泌纤维胶原的主要细胞。正常情况下,HSC处于静息状态,位于肝实质细胞与窦状小管内皮层细胞之间(Disse间隙),主要功能是储存维生素A,只产生少量的细胞外基质组分用于基质膜的形成。在损伤因子的持续作用下,HSC转变为表达α-SMA的肌成纤维细胞,合成和分泌大量的纤维胶原,尤其是Ⅰ型及Ⅲ型胶原,此外还有大量基质金属蛋白酶,如MMP-2、MMP-9等,以及它们的抑制剂TIMPs。越来越多的证据表明,TGF-β1是介导这一病理过程的主要因子,它通过激活下游的Smad信号通路参与该过程。Smad蛋白分为3种类型：Smad2/3是受体活化型Smad(R-Smad),Smad4是协同型Smad(Co-Smad),Smad6、7、8是抑制型Smad(I-Smad)。当TGF-β1与其受体结合后,Smad2/3的MH2区SSXS结构域的特定丝氨酸(ser)磷酸化而活化,随后与Smad4结合成多聚体并转入胞核,与靶基因结合形成转录复合体,激活目的基因的复制和转录,从而引发大量胶原的合成,形成肝纤维化。因此,通过靶向TGF-β/Smad信号通路调控HSC的活化和/或增殖或者促进HSC凋亡是防治肝纤维化的潜在靶点。大量研究表明,许多天然化合物具有保肝作用。蔓荆子是我国传统中草药的一种,其成熟的果实常被用作治疗头痛、感冒、偏头痛和目赤肿痛。紫花牡荆素(5,3’-二羟基-3,6,7,4’-四甲氧基黄酮),是从蔓荆子中提取的主要黄酮类化合物之一。其已被证实具有多种生物学活性,但大多数研究都集中于紫花牡荆素在不同类型的癌症中的抗肿瘤作用。近期研究表明,紫花牡荆素在体内及体外均有抗炎作用。在小鼠中,紫花牡荆素可以改善吸烟诱导的急性肺炎,可减少巴豆油所致耳皮炎和耳水肿。值得引起注意的是,最新的研究指出,紫花牡荆素在体外可以诱导HSC凋亡,且呈剂量和时间依赖性。然而,其在体内对HSC的作用及其是否具有抗纤维化的效能却尚未见报道。因此,本研究旨在通过构建小鼠肝纤维化的体内模型,探讨紫花牡荆素对肝纤维化的治疗作用及其作用机理,以期将紫花牡荆素作为防治肝纤维化的药物应用于临床提供理论依据。二、研究方法1、我们将体重近似的同龄C57小鼠随机分为4组：空白对照组(Control)、紫花牡荆素对照组(Casticin)、四氯化碳疾病组(CC14)以及紫花牡荆素治疗组(CCl4+Casticin),以腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠肝纤维化模型,造模6周后再灌胃给予紫花牡荆素(20mg/kg)治疗2周,实验结束后统一取材,观察分析。2、通过对各组小鼠血液进行生化分析,对小鼠肝脏进行HE染色、苦味酸-天狼星红染色及肝组织胶原含量测定,检测紫花牡荆素在体内对小鼠肝纤维化的作用。3、利用Western blot、免疫组化及Real-time PCR检测紫花牡荆素对标志HSC活化的相关分子-—α-SMA、α1(I)collagen、MMP-2、MMP-9、TTMP-1、TIMP-2及TGF-β1等表达的影响,同时检测TGF-β/Smad信号通路下游p-Smad2(S465/467)和p-Smad3(S423/425)的蛋白表达水平。4、利用人肝星状细胞系——LX2细胞开展体外实验,通过CCK8及Western blot检测紫花牡荆素对细胞增殖和凋亡的影响。5、使用TGF-p1刺激LX2细胞,通过免疫荧光、Real-time PCR及Western blot检测一系列HSC活化标志物的表达及紫花牡荆素的干预对这些标志物的影响,同时检测p-Smad2/3的表达,以明确和验证紫花牡荆素在其中的潜在作用机制。三、研究结果1、紫花牡荆素改善了CCl4所致肝功能损伤及肝组织病变本论文对紫花牡荆素的体内研究采用了治疗性给药的方案,即在肝纤维化模型诱导成功后给予药物治疗以观察药物的效应。首先,我们观察了紫花牡荆素对CCl4所致肝脏纤维化的损伤是否具有改善作用。我们通过测定小鼠血清中ALT和AST水平来观察紫花牡荆素对肝功能的影响。结果表明,紫花牡荆素的治疗改善了CCl4引起的肝损伤,降低了CCl4引起的小鼠血清ALT和AST的升高；而紫花牡荆素对照组二者水平与Control组相比无显著变化,说明紫花牡荆素对正常的肝组织无损伤作用即无肝毒性。以HE染色进行组织病理学检查显示,正常小鼠的肝组织肝小叶完整,肝细胞排列整齐；而CCl4疾病组小鼠的肝组织可见大量发生脂肪变、炎性浸润、气球样变、甚或坏死的肝细胞,且出现明显纤维间隔,纤维结缔组织以汇管区为中心明显增生,逐渐向肝小叶内延伸并包绕肝细胞,但尚未见明显假小叶形成。给予紫花牡荆素治疗后,肝组织的病变得到明显改善。组织学病理评分显示,紫花牡荆素的治疗减轻了CCl4引起的肝组织的炎症及纤维化程度,纤维化病理评分与CCl4疾病组相比具有统计学意义(p<0.001)；同样,紫花牡荆素对照组与Control组相比无显著变化。2、紫花牡荆素减轻了CCl4诱导的肝纤维化接下来,我们对各组小鼠的肝组织样本进行狼红染色,检测肝组织胶原沉积情况。我们发现,CCl4疾病组小鼠的肝脏胶原纤维较Control组小鼠显著增多,汇管区周围及小叶间动、静脉壁均可见明显胶原染色,而给予紫花牡荆素治疗可以有效地减少肝组织中的胶原沉积及纤维间隔的形成。我们将各组小鼠的肝组织狼红染色切片在10X镜下拍照,每个样品随机选取3个100X的视野,在Image pro-plus软件中进行图像分析,对各组样品间代表胶原的红色区域进行检测比较,统计结果表明：紫花牡荆素治疗组肝组织的胶原含量低于CCl4疾病组,差异具有统计学意义(p<0.05)。此外,我们还对各组小鼠肝组织中的羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量进行了检测。检测结果表明,紫花牡荆素降低了肝纤维化小鼠肝组织中的HYP水平,和上述狼红染色结果吻合,进一步表明了紫花牡荆素可以抑制胶原的生成,减轻肝纤维化。3、紫花牡荆素减轻肝纤维化的机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路,减少HSC活化实现的。为了明确紫花牡荆素减轻肝纤维化的作用机制,我们对HSC的活化情况进行了考察。首先以免疫印迹法检测了肌成纤维细胞标志物α-SMA及vimentin在肝组织中的表达情况。结果显示,与正常小鼠相比,纤维化小鼠肝脏中二者均显著高表达,提示纤维化肝脏中的HSC大量活化；而给予紫花牡荆素干预后,上述HSC活化指标均表达下降,提示紫花牡荆素对HSC的活化具有抑制作用。对各组肝组织样品进行α-SMA的免疫组化染色亦得到了同样的结论。为进一步确证紫花牡荆素抑制了HSC的活化,我们用Real-time PCR检测了MMP-2、 MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及TGF-β1的mRNA表达水平。结果显示：紫花牡荆素在mRNA水平降低了纤维化肝脏中显著增加的以上HSC活化相关分子的含量。而其中,值得特别关注的是,TGF-β1的表达在纤维化肝脏中显著增高,但可被紫花牡荆素的干预降低。这一现象提示我们,紫花牡荆素可能通过减少TGF-β1的表达抑制HSC的活化。因此,我们接下来进一步对TGF-β1启动的TGF-β/Smad信号通路进行了检测。结果表明,与CCl4疾病组相比,紫花牡荆素的治疗可下调p-Smad3(S423/425)的表达水平。4、紫花牡荆素抑制LX2细胞增殖,诱导其凋亡为了进一步探讨和验证紫花牡荆素抗纤维化的作用机制,我们利用LX2细胞开展了体外细胞实验。细胞增殖检测结果显示,LX2细胞的增殖明显被紫花牡荆素抑制,且呈剂量依赖性。此外,我们检测了紫花牡荆素对LX2细胞的促凋亡效应。我们通过免疫印迹检测细胞cleaved PARP的蛋白表达水平,结果显示：未处理的LX2细胞几乎不表达cleaved PARP,而经紫花牡荆素干预的LX2细胞,其cleaved PARP的表达增多,且呈现时间及浓度依赖性。以上研究结果表明：紫花牡荆素抑制LX2细胞增殖,同时促进其凋亡。5、紫花牡荆素通过靶向TGF-β/Smad信号来抑制LX2细胞活化及胶原基质的表达接下来,我们检测了紫花牡荆素是否能够抑制LX2细胞的活化。对LX2细胞进行α-SMA蛋白的免疫荧光染色,我们发现,未经任何处理的LX2细胞呈现自然伸展的星形,予TGF-β1刺激后,α-SMA蛋白表达增强,而给予紫花牡荆素处理后,细胞触角消失,形态偏圆,α-SMA蛋白的表达显著减弱。我们提取各组细胞的RNA进行了Real-time PCR,对α-SMA、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 TIMP-2及TGF-β1的mRNA表达水平进行了检测,得到的结果与体外实验结果相一致,即紫花牡荆素在mRNA水平降低了LX2细胞中代表其活化水平的相关分子含量。然而,紫花牡荆素是通过怎样的细胞信号转导途径影响HSC?为了验证我们在肝纤维化小鼠体内实验中得出的推论,我们检测了TGF-β/Smad信号通路中的关键分子p-Smad2/3的蛋白水平。免疫印迹结果显示：予TGF-β1刺激后的LX2细胞,其p-Smad2/3的表达明显上调,而紫花牡荆素的干预可明显减少p-Smad2/3的表达(图1-17)。这一结果表明,紫花牡荆素通过靶向TGF-β/Smad信号来抑制HSC活化,减少胶原基质的表达。四、结论1、体内实验表明,紫花牡荆素可改善CCl4所致肝功能损伤及肝组织病变,能够减轻CCl4诱导的肝纤维化,其抗肝纤维化的作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路,从而减少HSC的活化实现的。2、体外实验表明,紫花牡荆素能抑制LX2细胞增殖,诱导其凋亡,且能通过靶向TGF-β/Smad信号抑制LX2细胞活化,减少胶原基质的表达。3、我们的研究表明,紫花牡荆素具有护肝、抗纤维化、化学预防等作用,为后期的新药开发和临床试验提供了必要的依据。