蛋白质的可逆磷酸化在体内是一个动态的平衡过程,是由可以催化ATP或GTP分子上的磷酸转移至底物蛋白质氨基酸残基上的蛋白质激酶与催化完成逆向过程的磷酸酶共同调节完成的。它调控着几乎所有的生命活动,包括细胞的生长增殖、分化发育、凋亡代谢、蛋白合成、肌肉收缩、神经活动以及肿瘤的发生等。在蛋白质磷酸化作用中,酪氨酸残基的磷酸化作为较高级的进化形式和复杂的多细胞生命的特征表现得尤为重要和突出。细胞酪氨酸磷酸化平衡的破坏会导致许多人类疾病的发生,因此,严格控制PTK(蛋白酪氨酸激酶)和PTP(蛋白酪氨酸磷酸酶)活性的具有重要的生理意义。Janus Kinase(JAK),是非受体型酪氨酸激酶中一个重要的家族,包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2,在介导细胞因子等刺激的信号传导中发挥重要作用。JAK具有“激活环”,其在所有JAK家族中都是由串联的酪氨酸残基组成,对于其自身磷酸化激活和调节激酶活性有着重要作用。串联自磷酸化位点的磷酸化是JAK激酶活化的起始步骤,并开启信号向下游JAK-STAT通路的传导。然而JAK家族激酶的突变尤其是过度活化与许多人类疾病的发生密切相关。例如JAK1的突变与急性早幼粒细胞性白血病(APML)的发展相关。JAK2的突变与红细胞和B细胞两个谱系的肿瘤形成相关,如骨髓增殖性肿瘤(MPN)的发生。JAK3的活性突变与急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和淋巴瘤相关。因此,抑制JAK激酶的活性进而治疗相关疾病已成为该领域的研究热点。目前国外有几种用于治疗各种免疫和肿瘤疾病的JAK抑制剂药物已经上市,还有大量的有望成为药物的JAK抑制剂正在进行临床试验。另一方面,对于JAK激酶活性的负调节中最为重要的一部分就是PTP家族成员的去磷酸化作用。PTP除了调控蛋白质激酶产物的磷酸化状态外,也可直接调节PTK的活性,这是由于许多激酶活性也受磷酸化作用的调节,PTP对这些酪氨酸残基的去磷酸化将导致相应的蛋白质激酶失活。例如,有文献表明TYK2和JAK2是PTP1B的真正底物,并证明PTP1B在细胞因子信号传导的负调节中起作用。鉴于JAK“激活环”内的串联自磷酸化位点是激酶活化的起始步骤,并且两个串联自磷酸化位点的磷酸化程度将影响JAK激酶的活性,因此研究PTPs对JAK家族串联自磷酸化位点的磷酸化状态的影响对于揭示PTPs对JAK活性的负调控机制具有重要的意义。传统的蛋白质磷酸化分析包括抗体检测、放射性同位素标记法、酶联免疫法和荧光标记等方法,但这些传统的方法并不能有效地区分串联的双磷酸化位点。近年来,质谱方法以其低噪音、高稳定性、高灵敏度的优势在蛋白质磷酸化研究分析中发挥了重要作用,并得到了广泛的应用。本文对几种重要的非受体型PTP进行了原核表达和纯化,并在体外利用这些PTP对含有JAK家族自磷酸化位点的短肽进行了去磷酸化的研究,通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)的检测手段,建立一种PTP对JAK家族串联自磷酸化位点去磷酸化过程分析的方法。获得了PTP1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2和He PTP对JAK1、JAK2、JAK3和TYK2串联自磷酸化位点的去磷酸化过程以及不同的PTP对自磷酸化位点的优先选择性问题的重要数据,为揭示不同的PTP对JAK激酶家族串联自磷酸化位点的负调控机制奠定了理论基础。