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从金乡、济宁农科院农田中采集13个棉花根际土壤样品,通过平板培养法,获得1277个细菌分离物。以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)为指示菌,采用平板对峙法初筛获得对棉花立枯病具有拮抗作用的25个细菌分离物,其中MH1和MH25对棉花立枯病抑制效果明显,具有作为生防制剂的潜力。通过形态观察、生理生化测定和16S rDNA测序分析,将MH1鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),MH25鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。根据已报导的芽孢杆菌非核糖体合成抗生素的操纵子保守序列,设计兼并性引物TGD(5’-TWYCGIACIGGIGAYYKIGKICG-3’)和LGG(5’-AWIGARKSICCICCISSRIMRAARAA-3’)。通过PCR扩增,得到818bp的DNA片断。将序列测定结果在NCBI上进行BLAST,选择同源性较高的Bacillus subtilis RB14的IturinA操纵子序列、Bacillus subtilis AU195的Bacillomycin D操纵子序列、Bacillus subtilis ATCC6633的Mycosubtin操纵子序列,分析其同源序列,分别设计14对和6对引物,相邻片断之间有不同长度的重叠序列。扩增之后,选择适当大小的PCR产物,连接载体进行测序,在NCBI中比对,确定是与抗生素相关的序列之后,根据重叠序列将其拼接,最终获得了38845bp长度的DNA片断。利用DNAman软件,对获得的片断进行分析,初步结果该片断含有四个ORF,将其四个ORF分别与Bacillus subtilis RB14的IturinA操纵子序列的四个对应ORF序列进行比对,发现ORF1与ituD相似性为99%, ORF2与ituA相似性为98.70%, ORF3与ituB相似性为98.99%, ORF4与ituC相似性为99.48%,每个ORF中又含有不同功能的结构域,在ORF1上游序列中,发现有TATACACA-16bp-TAGGAT序列,推测其可能是该操纵子的启动子,但是其与σA-10和-35(TTGACA-17bp-TATAAAT)有差别。采用同源重组的方法,敲除Bacillus subtilis MH25 ituB基因的色氨酸腺苷酸化区域。首先以Bacillus subtilis MH25基因组DNA为模板,PCR扩增出Tyr区域的DNA片断,将其连接到载体pMD18-T,构建质粒pMDT,然后用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ分别对质粒pMDT和pBRMCS-5双酶切,连接构建了重组质粒pBRMT,最后用PstⅠ分别对质粒pBRMT和pUC4K单酶切,构建了重组质粒pBRMTK。再以重组质粒pBRMTK为模板,PCR扩增tyr::Km片断,通过原生质体转化,将其转入Bacillus subtilis MH25中,在30μg/mL卡那霉素的抗性CMR平板上,筛选重组子,但是未筛选到重组子。