[研究目的]随着全球人口的老龄化,骨质疏松症（osteoporosis,OP）的发生率逐年升高,目前已经是一种最常见的老年性疾病,其病理特征是以骨量减少和显微结构破坏为主要特点,从而导致骨强度下降,骨脆性增加,容易发生骨折。骨质疏松所致的脊柱或髋关节骨折的患者由于需要长期卧床,使得肺部感染与血栓栓塞等严重并发症的发生率明显增加,患者死亡率明显升高,造成了严重的社会和经济负担。目前骨质疏松症已成为全球关注的老年性疾病之一,流行病学资料调查显示,骨质疏松症患者发生脆性骨折的风险高达40%,中国目前已经成为世界上老年人口最多的国家,随着预期寿命的延长,骨质疏松症的发生率也呈逐渐上升趋势。因此,深入研究骨质疏松症的发病机制,明确其关键致病基因、寻找新型药物的治疗靶点对于骨质疏松症的早期诊断、治疗及新药研发均具有重要的研究意义。现已明确,慢性炎症与骨质疏松症的发生密切相关,炎症导致的破骨细胞过度活化造成骨转换失衡是其中的关键因素。慢性炎症产生的相关细胞因子能使破骨细胞前体细胞活化,导致骨吸收增多和骨形成减少,使病人罹患骨质疏松症和骨质疏松性骨折的风险明显增加,其主要机制就是炎症导致的OPG-RANK-RANKL体系的失衡。慢性炎症会产生大量的炎性因子,其中TNF-a、IL-1、IL-6等炎症因子均可刺激RANKL的大量表达,促进其与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合,从而诱导多核破骨细胞的分化成熟,其中NF-κ B通路的激活则处于关键环节。因此,破骨细胞的分化依赖于RANKL诱导的NF-κ B激活。当NF-κ B信号通路被抑制后,破骨细胞形成的数量也明显减少,骨质侵蚀程度等关节炎表现也明显降低。相关研究已经证实NF-κ B不仅在炎症通路中起重要作用,也是破骨细胞分化成熟中的关键分子。TIPE2（tumor necrosis factor-a induced protein 8-like 2,TNFAIP8L2）与 TNFAIP8L（TIPE）、TNFAIP8L1（TIPE1）和 TNFAIP8L3（TIPE3）同属于 TNFAIP8家族,是近年新发现的一种重要的炎症和免疫自稳调节分子。在LPS诱导的炎症过程中,TIPE2功能主要是抑制核因子NF-κ B的活化以及蛋白AP-1的激活。而存在TIPE2基因缺陷的细胞会表现出对T细胞受体信号活化和Toll样受体的高反应性。TIPE2基因被敲除后的小鼠会出现多器官自发性炎症,表现为脾肿大、体重下降等,且炎症反应会不断加剧,最终导致死亡。TIPE2的表达失衡与系统性红斑狼疮、乙型肝炎、糖尿病肾炎等炎症性疾病密切相关。而TIPE2在骨质疏松症中的表达水平如何?是否与骨质疏松症的发生与发展存在相关性?目前仍不明确。在LPS诱导的炎症过程中TIPE2可影响NF-κ B的激活,但在破骨细胞活化过程中其是否调控NF-κ B信号通路?具体分子机制如何?目前尚无相关性研究。炎症过程中,RANKL-RANK激活NF-κ B引起破骨细胞过度活化,导致骨转换失衡,进而引发骨质疏松,我们根据文献及前期实验基础推测TIPE2在该过程中发挥了关键作用。本研究在前期基础上,利用多种分子生物学手段,将阐述TIPE2通过负调控NF-κ B通路影响破骨细胞活化,参与骨质疏松发生进程,并初步探讨其机制。[研究方法]一、检测TIPE2的表达水平,并与炎症因子、破骨细胞活化指标做相关性分析收集80名骨质疏松患者（35名骨折组,45名非骨折组）与90名健康对照者的一般资料,分别测定其腰椎及股骨颈的骨密度,并收集其外周血标本。采用电化学发光法检测骨代谢指标:骨吸收标志物β胶联降解产物（β-CTX）和骨形成标志物I型胶原氨基端前肽（P1NP）。采用ELISA法检测外周血中IL-1 β、IL-6、TNF-a等炎症因子的水平。采用Real-Time PCR和Western-blot法检测外周血单个核细胞中TIPE2基因与蛋白的表达情况,并通过Spearman相关性分析TIPE2表达水平与患者血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α等炎症因子、BMD以及骨代谢标志物的相关性。使用Simple Logistic Regression、R0C分析计算AUC值分析TIPE2对骨质疏松症患者脆性骨折的预测功能。二、外周血单个核细胞转染TIPE2慢病毒后LPS刺激实验采用Ficoll密度梯度离心法分离骨质疏松患者及对照组外周血单个核细胞在DMEM中进行培养,转染TIPE2过表达慢病毒后用LPS刺激。ELISA法检测培养上清中IL-1 β、IL-6、TNF-a等炎症因子的水平,采用Real-Time PCR和Western-blot法检测NF_κ B通路活化情况。三、建立体外细胞模型,研究TIPE2参与骨质疏松的初步机制采用二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装构建TIPE2干扰慢病毒载体。获取小鼠骨髓单核巨噬细胞,并在体外进行分离、培养及扩增,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测小鼠骨髓单核巨噬细胞表面抗原CD11b的表达。用TIPE2 siRNA慢病毒载体（TIPE2-si）分别转染小鼠骨髓来源单核巨噬细胞及RAW264.7细胞系为模型,Real-Time PCR检测病毒转染成功率。然后用RANKL刺激其向破骨细胞分化,TRAP染色检测破骨细胞活化程度;ELISA法检测上清中炎症因子（IL-1 β、IL-6、TNF-a）变化;Real-Time PCR检测破骨细胞活化指标TRAP、Mmp9、Cathepsin K、NFATcl 及 NF-κ B 信号通路活化关键基因 11-6、Birc3、Tnf-α、Cox-2等的表达水平;Western blot检测NF-κ B活化指标p65的磷酸化情况。[研究结果]一、TIPE2表达水平及其与炎症因子、破骨细胞活化指标、BMD的相关性1.结果显示:不管是mRNA还是蛋白水平,骨质疏松症患者的TIPE2表达水平显著低于健康对照者。更有意义的是,TIPE2 mRNA表达与血清中IL-1,IL-6和TNF-α等炎症因子水平呈负相关。以上结果表明,TIPE2可能参与骨质疏松症的发生发展过程,并通过抑制炎性细胞因子的分泌参与骨质疏松症的疾病进程。2.分析TIPE2和β-CTX及PINP之间的关系。结果显示TIPE2与β-CTX呈负相关。然而,TIPE2和PINP之间无明显统计学意义上的相关性。TIPE2与β-CTX之间的负相关性关系表明TIPE2可能通过抑制破骨细胞形成发挥其生物学功能。3.分析TIPE2与BMD之间的关系,结果显示,TIPE2与骨质疏松症患者腰椎（L1-L4）和股骨颈BMD值呈显著正相关,提示TIPE2可作为保护性因素参与骨质疏松症的疾病进程。4.利用Simple Logistic Regression方法观察其对骨质疏松症患者骨折的预测功能。结果发现骨折组的TIPE2表达显著低于对照组。更有意义的是,TIPE2具有显著的统计学意义用来预测骨质疏松症患者的骨折风险,TIPE2具有良好的AUC值来预测骨质疏松症患者骨折概率。5.外周血单个核细胞转染TIPE2慢病毒后LPS刺激实验将骨质疏松症患者的单核细胞在DMEM中培养,转染TIPE2慢病毒及对照病毒后用LPS刺激。结果显示,转染TIPE2后,培养上清液中的TNF-α、IL-1 戶、IL-6等促炎细胞因子明显减少,Western blot检测结果显示NF-κ B通路活化明显减弱,表明TIPE2可抑制单核细胞对LPS刺激的敏感性。该结果进一步表明TIPE2表达水平下降可能是骨质疏松症的发病机制之一。二、体外细胞模型研究TIPE2参与骨质疏松的初步机制1.用TIPE2 siRNA慢病毒质粒（TIPE2-si）感染小鼠骨髓来源巨噬细胞及RAW264.7细胞系,然后用RANKL刺激后,TRAP染色显示破骨细胞活化明显增多。2.在小鼠骨髓来源巨噬细胞及RAW264.7细胞培养中,干扰TIPE2表达,然后用RANKL刺激,Real-Time PCR结果显示破骨细胞活化标志物Trap、Mmp9、Cathepsin K（Ctsk）、Nfatcl 和 NF-κ B 通路激活指标 11-6、Birc3、Tnf-α、Cox-2等基因表达明显上调。3.ELISA法检测培养上清中NF-κ B调控基因TNF-α、IL-1 β、IL-6等炎症因子出现明显上调现象。4.Western Blot法检测NF-κ B通路p65及p-p65变化,结果显示干扰TIPE2表达后p-p65明显上调。[研究结论]1.骨质疏松症外周血单个核细胞中TIPE2表达水平下降,且与IL-1,IL-6和TNF-α等炎症细胞因子、骨吸收标志物β-CTX呈负相关,TIPE2可能通过抑制炎症因子的分泌以及破骨细胞的活化参与骨质疏松的发生与发展。2.TIPE2表达水平与BMD呈正相关,可预测骨质疏松症患者骨折的风险。3.TIPE2可抑制LPS刺激骨质疏松症患者单核细胞引起的活化。以上结果表明TIPE2表达下降可能是骨质疏松症的发病机制之一。1.干扰TIPE2表达后破骨细胞活化明显增多,相关基因（Trap,Mmp9,Ctsk）,NF-κ B 调控基因（11-6,Birc3,Tnf-α,Cox₂）均明显上调;NF-κ B 调控的TNF-α、IL-1 β、IL-6等炎症因子明显上调。2.破骨细胞活化过程中,干扰TIPE2表达后,NF-κ B通路活化的p-p65明显上调。以上结果表明TIPE2可通过负调控NF-κ B通路抑制破骨细胞的活化,参与骨质疏松的发病过程。