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铅(Pb)是一种广泛存在于自然环境中且不易被降解的重金属,进入体内可通过与多种蛋白质、氨基酸等物质的结合,干扰机体正常生命活动,并对机体损伤具有多系统和多器官的特点。肾脏是铅毒性损伤的重要靶器官,肾小管是铅肾毒性损伤的重要靶部位。前期研究表明,细胞凋亡是低剂量铅暴露所致肾小管上皮细胞死亡的主要方式。细胞自噬是动物机体内一种动态的生物学过程,是机体重要的防御保护机制。但本课题组新近研究发现自噬抑制在铅致肾小管上皮细胞毒性损伤中发挥重要作用。近年来,细胞自噬与细胞凋亡之间的相互作用及关联是生命科学领域的热点,但细胞自噬与细胞凋亡间的相互关联在铅所致肾毒性中的作用尚未阐明。鉴于此,本研究以铅染毒的原代大鼠肾小管上皮(rPT)细胞建立铅致肾损伤的体外模型,重点探讨细胞自噬与细胞凋亡在铅致肾毒性中的作用。首先,本实验对Pb染毒对大鼠肾小管上皮细胞内自噬体形成的影响展开了探究。在Pb染毒过程中添加了作用于自噬体形成阶段的自噬调控剂,即自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂RAPA,采用免疫印迹技术检测LC3-II与自噬体形成过程中2个关键蛋白ATG5和Beclin-1的蛋白水平变化。实验结果证实,Pb染毒可促进大鼠肾小管上皮细胞内自噬体的形成。其次,探讨了调控自噬体的形成对Pb致大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。实验中采用化学药物(3-MA和RAPA)与基因技术(沉默自噬相关基因Atg5)调控自噬体的形成,通过免疫印迹技术检测凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平、流式细胞术检测细胞凋亡率、共聚焦显微镜进行凋亡形态学观察,最终结果表明抑制自噬体的形成加重了Pb导致的细胞凋亡,而促进自噬体的形成可缓解Pb导致的细胞凋亡。再次,探讨调控自噬体的降解对Pb致细胞凋亡的影响。在Pb染毒过程中添加BA,后采用免疫印迹技术检测LC3-II和p62以及cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、共聚焦显微镜进行细胞凋亡形态学观察,实验结果表明,抑制自噬体的降解加重铅致大鼠肾小管上皮细胞凋亡。最后,我们探究了调控自噬对Pb致细胞毒性的影响。基础水平下的自噬在急性肾损伤中具有保护作用,为了更加全面探讨细胞自噬在铅致细胞毒性中的作用,在Pb染毒过程中,我们添加了一系列调控自噬的药物即3-MA、RAPA和BA与敲减自噬相关基因Atg5正负调控自噬,采用CCK-8法检测细胞存活率,结果显示采用RAPA促进自噬可提高细胞存活率,而自噬抑制剂3-MA和BA,以及敲减自噬相关基因Atg5抑制自噬则降低了细胞存活率。结果表明自噬抑制直接导致了铅染毒所致的细胞毒性。综上所述,在肾小管上皮细胞内Pb可以促进自噬体的形成,但是会抑制自噬体的降解从而抑制自噬;抑制自噬体的形成可以加重铅诱导的肾小管上皮细胞凋亡,而促进自噬体的形成可以抑制Pb诱导的肾小管上皮细胞凋亡;自噬抑制直接导致了铅染毒所致的细胞毒性。本研究从自噬与凋亡相互作用的角度出发,进一步阐明了铅的肾毒性机制,为防治重金属铅污染导致的肾脏疾病提供更加理性的意见与科学依据。