皮肤黑素瘤是一种高度恶性的黑素细胞肿瘤,不易受化疗药物的干扰且易发生转移,预后不良。对其发病机制、治疗方法的研究是国内外皮肤肿瘤研究的热点。钠氢交换子调节因子-1(NHERF1)是一种支架蛋白,其在调节离子转运、运输中发挥着重要作用,同时它还与膜-细胞骨架连接蛋白相互作用,可以稳定跨膜蛋白,并参与构成上皮顶端微绒毛结构。它还是一种调节蛋白,能与30余种蛋白质作用并调节其功能。随着近年来研究的深入,有学者发现其在多种肿瘤中发挥着重要作用：其基因的突变或杂合性丢失可导致肿瘤细胞的恶性程度增高。其在正常细胞中通常为胞膜表达,发挥抑癌作用；胞膜不表达或在胞浆及胞核中过表达则提示肿瘤恶性程度增加。然而,尽管越来越多的研究表明其在癌症中发挥着重要的作用,但目前对其在肿瘤、尤其在皮肤恶性黑素瘤中的作用及作用机制仍知之甚少。在进一步的研究中除了不断探索其抗肿瘤的机制,其对肿瘤生物学行为的影响及临床意义将成为研究重点。(1) NHERF1及β-联蛋白在皮肤黑素瘤及痣细胞痣组织中的表达及意义为了探讨NHERF1是否参与了皮肤黑素瘤的发生发展过程,我们收集47例皮肤黑素瘤组织及37例痣细胞痣组织,应用免疫组化方法对NHERF1和β-联蛋白在组织中的表达模式(膜表达、浆表达及核表达)进行检测。结果显示：原位皮肤黑素瘤组织中NHERF1胞浆中等/强阳性表达率为38%；而侵袭性皮肤黑素瘤组织中NHERF1胞浆中等/强阳性表达率为71%,两组相比具有统计学显著性差异。同时,全部皮肤黑素瘤组织中NHERF1胞浆中等/强阳性表达率为60%,而痣细胞痣组织中NHERF1胞浆中等/强阳性表达率为0,有明显统计学差异。原位皮肤黑素瘤组织中可见β-联蛋白胞浆中等/强阳性表达率为50%；而侵袭性皮肤黑素瘤组织中可见β-联蛋白胞浆中等/强阳性表达率为84%。全部皮肤黑素瘤组织中β-联蛋白胞浆中等/强阳性表达率为72%,而在痣细胞痣组织中β-联蛋白胞浆中等/强阳性表达率为30%,两组相比具有统计学显著性差异。NHERF1及β-联蛋白在痣细胞痣、原位黑素瘤及侵袭性黑素瘤组织中的胞浆阳性表达率均随着病变组织的恶性程度增加而升高。为了进一步探讨NHERF1对β-联蛋白及黑素瘤的影响,我们将在实验的第三部分,利用shRNA干扰技术进行深入的了解。(2) NHERF1及β-联蛋白在黑素瘤细胞株A375,M14,MV3中的表达及意义从第一部分的研究中观察到NHERF1及β-联蛋白在痣细胞痣、原位黑素瘤及侵袭性黑素瘤组织中的异常胞浆阳性表达率随着病变组织的恶性程度增加而升高。为了研究NHERF1及β-联蛋白在黑素瘤细胞株A375,M14,MV3中的表达及意义。培养黑素瘤细胞株A375、M14、MV3及黑素细胞；使用免疫细胞化学法、实时荧光定量-PCR法、免疫印迹法对黑素瘤细胞株A375、M14、MV3及黑素细胞中NHERF1及β-联蛋白的表达情况进行观察；并使用MTT法对黑素瘤细胞株A375、M14、MV3及黑素细胞的增殖情况进行检测。结果发现：NHERF1及β-联蛋白在黑素细胞中同时表现为细胞膜阳性表达,而在黑素瘤细胞株A375, M14, MV3中均出现膜表达的缺失,同时呈现不同程度的细胞浆和/或细胞核阳性表达。在三株黑素瘤细胞株中,MV3细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色仅呈少部分细胞胞质弱阳性表达,实时荧光定量-PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最低,免疫印迹法中未见NHERF1蛋白表达条带,而其在MTT法中检测到的的增殖速度最快,明显高于另外两株细胞；A375细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色呈细胞浆及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量-PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最高,免疫印迹法中可见NHERF1蛋白最强阳性表达,而其增殖速度却明显慢于MV3细胞。同时,p-联蛋白在MV3细胞中免疫细胞化学染色呈细胞浆及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量-PCR检测的mRNA表达水平最高,免疫印迹法检测到蛋白最强阳性表达；而A375细胞及M14细胞中,p-联蛋白在免疫细胞化学染色呈相对弱的细胞浆阳性表达,实时荧光定量-PCR检测的mRNA表达水平明显较低；免疫印迹法中的蛋白表达较MV3中的表达低。与正常黑素细胞相比,黑素瘤细胞A375, M14, MV3中的NHERF1的mRNA表达水平都呈不同程度升高,而β-联蛋白表达水平(mRNA表达水平及蛋白水平)亦存在不同程度升高,同时,黑素瘤细胞中的NHERF1与p-联蛋白存在着差异性表达,黑素瘤细胞胞浆中的NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低则细胞的增殖可能越快。为了深入探讨NHERF1在黑素瘤细胞中对β-联蛋白及黑素瘤细胞增殖的影响,我们将在实验的第三部分,利用慢病毒载体shRNA干扰技术进行深入的了解。(3) A375细胞中NHERF1的基因沉默对β-联蛋白的表达及A375细胞增殖、凋亡的影响作用从第二部分的研究中观察到,黑素瘤细胞中的NHERF1与β-联蛋白存在着差异性表达。黑素瘤细胞胞浆中的NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低则细胞的增殖可能越快。因此在本部分实验中,我们设计并合成NHERF1的shRNA干扰片段,并载入pLVX-shRNA-puro载体中,载体转化到Ecoli感受态中。采用PCR及基因测序等方法对重组质粒进行鉴定。慢病毒包装,慢病毒感染靶细胞,多克隆细胞的验证,单克隆筛选稳定干扰NHERF1的A375细胞株,并采用酶切鉴定、基因测序、qPCR和Western blotting对转染效果进行鉴定。使用Western blotting检测稳定干扰NHERF1的A375细胞株中NHERF1及β-联蛋白的蛋白表达量,以对照序列干扰细胞为对照,并使用MTT法检测两种细胞的增殖情况,Annexin-V/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果发现设计的shRNA-NHERF1干扰片段载入pLVX-shRNA-puro载体中,并稳定转染A375细胞后,经qPCR和Western blotting检测NHERF1表达明显下降,NHERF1沉默的A375细胞中β-联蛋白较对照细胞中的表达增高,同时A375细胞的增殖速度较对照细胞明显增快。所设计的shRNA-NHERF1干扰片段对A375细胞中NHERF1的表达起到了明显的抑制作用,NHERF1基因沉默导致β-联蛋白的表达增高,细胞增殖加快,细胞凋亡减少。结论在皮肤黑素瘤细胞中NHERF1与β-联蛋白呈差异性表达,并可能通过与β-联蛋白的相互作用而调节β-联蛋白的表达水平,从而影响细胞增殖和凋亡。NHERF1在皮肤黑素瘤组织及细胞中的表达较良性痣细胞痣组织及正常黑素细胞均呈不同程度的异常细胞浆阳性表达模式。