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背景:星形胶质细胞的活化和炎症反应加重脑缺血后神经元的凋亡,导致神经功能缺损。白藜芦醇(Resveratrol,Res)能抑制星形胶质细胞的活化和炎症反应,从而保护神经元,然而其机制尚未阐明。Sonic hedgehog(Shh)信号通路对脑缺血后神经保护有重要作用,但其是否介导白藜芦醇抑制脑缺血后星形胶质细胞的活化和炎症反应尚不清楚。此外,白藜芦醇是Sirtuins1(Sirt1)的特异性激动剂,Shh信号通路和Sirt1之间的关系如何,需进一步进行探讨。目的:探讨白藜芦醇是否在氧糖剥夺/再复氧(OGD/R)损伤后通过激活Shh信号通路影响星形胶质细的活化及炎症反应,且白藜芦醇是否通过Sirt1激活Shh信号通路。方法:原代分离培养24h内新生SD大鼠的大脑皮层星形胶质细胞,行氧糖剥夺150 min,再复氧培养24 h。1.白藜芦醇对OGD/R损伤后星形胶质细胞活力的浓度效应。实验分为:(1)正常组(normal,Nor),(2)对照组(control,Ctrl),(3)溶剂组(vehicle,Veh),(4)不同浓度的白藜芦醇预处理组(1、5、20、40、80、100μmol/L,Res)。2.白藜芦醇对OGD/R损伤后星形胶质细胞活化和炎症反应的影响。实验分为:(1)正常组(normal,Nor),(2)对照组(control,Ctrl),(3)40μmol/L白藜芦醇预处理组(Res)。3.白藜芦醇对OGD/R损伤后星形胶质细胞Shh信号通路的影响。实验分为:(1)正常组(normal,Nor),(2)对照组(control,Ctrl),(3)40μmol/L白藜芦醇预处理组(Res),(4)Shh受体Smo抑制剂环王巴明组(Cyclopamine,Cyc),(5)40μmol/L白藜芦醇+环王巴明组(Res+Cyc),(6)40μmol/L白藜芦醇+Shh受体Smo激动剂组Purmorphamine组(Res+Pur)。4.Shh信号通路对OGD/R损伤后星形胶质细胞活化和炎症反应的影响。实验分为:(1)模型组(control,Ctrl),(2)40μmol/L白藜芦醇预处理组(Res),(3)40μmol/L白藜芦醇+环王巴明组(Res+Cyc)。5.Sirt1对Shh信号通路的影响。实验分为:(1)正常组(normal,Nor),(2)对照组(control,Ctrl),(3)40μmol/L白藜芦醇预处理组(Res),(4)Sirt1抑制剂组Sirtinol组,(5)Shh组(Shh)。采用CCK-8法检测细胞活力,免疫荧光法、Western blotting检测相关蛋白的表达和核移位,ELISA法检测相关蛋白的含量。结果:1.白藜芦醇对体外OGD/R损伤后星形胶质细胞活力影响的最佳浓度。在采用CCK-8法检测后,得到的结论是:随着白藜芦醇浓度(5、20、40μmol/L)的增高,细胞活力逐渐增高,且与对照组有显著性差异(P<0.01),以40μmol/L组细胞活力最强。之后随白藜芦醇浓度(80、100μmol/L)的增高,细胞活力显著降低,以100μmol/L组细胞活力最弱(P<0.05)。2.白藜芦醇对OGD/R损伤后星形胶质细胞的活化和炎症反应的影响。EdU检测显示在OGD/R损伤后,对照组和白藜芦醇组显著高于正常组EdU阳性细胞比例(P<0.01),而白藜芦醇组显著低于对照组(P<0.01)。蛋白免疫印迹法和ELISA法显示,对照组和白藜芦醇组GFAP、S100β、Vimentin、IL-10、IFN-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达或含量显著高于正常组(P<0.05),但白藜芦醇组除IL-10和IFN-β蛋白表达或含量较对照组增高外,其余均低于对照组(P<0.05)。3.白藜芦醇对OGD/R损伤后星形胶质细胞Shh信号通路的影响。免疫荧光染色显示,正常组Gli-1表达于细胞浆,OGD/R损伤后,Gli-1部分移位于细胞核;Res组和Res+Pur组,细胞核中Gli-1蛋白表达明显增强;Cyc组和Res+Cyc组均显著抑制了Gli-1蛋白的核移位,Cyc组抑制最强。WB显示,对照组、Res组和Res+Pur组Shh、Smo、Ptc-1和Gli-1蛋白表达明显高于正常组,Res组和Res+Pur组明显高于对照组,Res+Pur组明显高于Res组(各组P<0.01);Cyc组显著低于对照组、Res组和Res+Cyc组,Res+Cyc组显著低于Res组(各组P<0.01)。4.Shh信号对OGD/R损伤后星形胶质细胞活化和炎症反应的影响。Edu检测显示在OGD/R损伤后,白藜芦醇(Res)组和白藜芦醇+环王巴明(Res+Cyc)组显著低于模型组(Ctrl)的EdU阳性细胞数比例(P<0.01)。而白藜芦醇+环王巴明(Res+Cyc)组显著高于白藜芦醇组(P<0.01)。蛋白免疫印迹法和ELISA法显示,白藜芦醇(Res)组和白藜芦醇+环王巴明(Res+Cyc)组中GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达或含量较模型(Ctrl)组显著降低,其中(Res+Cyc)组中的表达或含量明显高于白藜芦醇(Res)组。Res组和(Res+Cyc)组的IL-10和IFN-β的蛋白表达或含量明显高于Ctrl组,其中(Res+Cyc)组的蛋白表达或含量显著低于Res组(各组均P<0.05)。5.Sirt1对Shh信号通路的影响。免疫荧光染色显示,正常(Nor)组,Gli-1在胞浆中积聚。OGD/R损伤(Ctrl)后,Gli-1部分转移到细胞核内。Res预处理组和Shh组,Gli-1大部分转移到细胞核内。然而,Sirt1抑制剂(Sirtinol组)则抑制Gli-1的核移位。Western Blotting显示,Ctrl组、Res组和Shh组的Shh、Smo、Ptc-1和Gli-1蛋白表达明显高于正常组,Res组和Shh组明显高于对照组(各组P<0.01),Sirtinol组明显低于Ctrl和Res组(各组P<0.01)。结论:白藜芦醇预处理可抑制OGD/R后星形胶质细胞的活化及炎症反应,其作用机制可能是通过Sirt1影响Shh信号通路。