胫骨软骨发育不良(Tibial Dyschondroplasia,TD)是常发生于快速生长禽类中的一种营养代谢性腿部疾病。肉鸡出现TD时主要症状为行走障碍、生长性能下降、胫骨发育畸形和精神萎靡等。据统计,TD在世界范围内发病率可达10%-30%,但是由于其多表现为亚临床症状而常被忽视。TD不仅抑制肉鸡的生长,还造成肉质减退,导致养禽业巨额的损失。此外,由于家禽TD的发生没有明显的地域性和显著的高发性,导致本病防治存在一定的困难。研究表明,TD与肉鸡品种、饲料和饲养环境密切相关。但是由于其发病原因多种多样,且尚未研发出用于预防和治疗TD的特异性药物,在我国肉鸡养殖中TD发病率可达10%左右,因此TD给我国肉鸡养殖带来的损失仍然不容忽视。为了深入了解TD的临床症状、病理变化、发病原因、发病机制及寻找相关的治疗药物。依据福美双构建TD模型,利用高通量测序技术筛选发生TD时显著变化的基因,并结合体内试验和体外试验,分析研究差异基因在肉鸡TD中的调控作用,为阐明TD发病机制和评估药物防治效果奠定基础。主要研究内容及结果如下:1.基于转录组对福美双诱导的TD相关基因的筛选与分析TD是家禽常见的一种营养代谢疾病,其主要表征是软骨生长板内形成白色软骨栓。先前的研究表明,TD与血管生成因子、缺氧诱导因子以及多种基因的异常表达密切相关。骨骼的发育涉及多个通路上基因和蛋白的表达,且任何一个环节出现问题都将会造成骨骼发育异常。本研究的目的是选用爱拔益加(AA)肉鸡,利用福美双造模,应用高通量测序技术筛选正常肉鸡和患TD肉鸡中差异表达的基因。本研究结果表明,对照组和TD组样本中共筛选出14380个表达基因,其中差异表达的基因有1128个。其中部分差异表达的基因在骨形成的过程中承担着重要作用,暗示着TD的发生可能与这些基因有关。差异表达基因GO分析结果显示谷氨酸分泌、多肽抗原结合和MHCⅠ类蛋白复合物的形成在TD发生过程中发挥着重要作用。同时,我们通过对KEGG富集通路分类统计发现,细胞过程类中细胞群体(Cellular community)有36个差异基因;环境信息处理中信号分子与相互作用(Signaling molecules and interaction)有64个差异基因;遗传信息处理中折叠、分类和降解(Folding,sorting and degradation)有6个差异基因;代谢中全局和概览示意图(Global and overview maps)有71个差异基因;机体系统内分泌系统(Endocrine system)有21个差异基因。结果提示,在TD的发生过程中存在多种基因交互式表达差异,多基因共同参与完成TD发病过程的表达调控机制。本研究通过RNA测序技术,分析了肉鸡发生TD时差异表达的基因,分析出肉鸡TD发生过程中显著差异表达的关键靶基因及其参与的代谢物质,为进一步探究TD发生机制奠定基础。2.差异基因在肉鸡TD的表达调控研究软骨成骨是一个复杂的过程,与软骨细胞、成骨细胞、血管分化密切相关,并受多种激素和细胞因子的调控。Ihh-PTHr P信号轴在肉鸡胫骨发育中,可调控软骨细胞发育,Wnt4和ColⅡ也被广泛证实参与动物骨细胞的增殖、分化和胶原蛋白的合成过程。本研究利用福美双造模,通过体内试验和体外试验研究发现,差异基因Ihh、Wnt4和ColⅡ在肉鸡TD组的表达较对照组下调,与第一章转录组筛选的差异基因结果一致。而在体内试验中,基因PTHr P在肉鸡TD组的表达上调;体外试验,基因PTHr P在对照组和TD组的细胞质(呈红色)中均有表达,差异不显著。研究结果表明:PTHr P、Ihh、Wnt4和ColⅡ基因的表达水平的变化对肉鸡TD发挥着重要的作用,可能作为参与TD发生的重要调控基因,该研究将为后续进一步对上述差异基因在肉鸡TD的中草药防治中表达调控研究奠定基础。3.柚皮苷对福美双诱导肉鸡TD的治疗作用TD可引起家禽腿部疾病和生长发育迟缓,且迄今为止尚未发现可治疗TD的特异性药物。柚皮苷用于治疗各种骨骼疾病。然而,柚皮苷是否可以治疗TD目前尚未得到证实。因此,本研究的目的是探讨中草药柚皮苷对福美双诱导的肉鸡TD的治疗作用。180只1日龄大的AA肉鸡随机分成三组,每组60只,分别为对照组(标准饮食),福美双组(福美双50 mg/kg,从第3天到第18天)和柚皮苷治疗组(柚皮苷100 mg/kg,从第8天到第18天)。在整个试验过程中,记录肉鸡的临床症状、胫骨参数和相关理化指标的变化等,以评估柚皮苷对TD肉鸡的保护效果。另外,通过RT-q PCR和Western blot确定Ihh和PTHr P基因和蛋白表达水平。结果发现,柚皮苷可以通过下调Ihh和上调PTHr P基因和蛋白表达,显著改善TD肉鸡的跛行症状。与TD组相比,柚皮苷组表现出更好的生长趋势,在第10-18天,两组的体重表现出明显差异(p<0.05或p<0.01);TD组在整个试验过程中,料肉比(FCR)明显升高(p<0.05或p<0.01),平均日增重(ADWG)和平均日采食量(ADFI)显著降低(p<0.01);柚皮苷组平均日增重(ADWG)和平均日采食量(ADFI)明显改善(p<0.05或p<0.01),料肉比(FCR)也明显下降。同时,柚皮苷的使用显著降低了发病肉鸡的生长板的宽度;服用柚皮苷18天后,柚皮苷组胫骨的重量和长度恢复,接近对照组水平。生化指标研究显示,TD组血清中ALT和AST水平显著上升(p<0.01),而AKP水平明显降低(p<0.01),柚皮苷组血清的ALT和AST明显低于TD组,而AKP水平高于TD组。TD组肝脏的抗氧化力受到了严重的影响。与对照组相比,TD组SOD浓度、GSH-Px和T-AOC水平明显降低,MDA含量明显升高(p<0.05或p<0.01),而柚皮苷通过提高GSH-Px、T-AOC、SOD水平,降低MDA水平,改善了肝脏的抗氧化能力。特别在第18天柚皮苷组的GSH-Px和SOD含量已恢复至对照组水平。研究结果表明,柚皮苷可以促进生长性能的提升,恢复生长板宽度,并改善肉鸡肝脏由于福美双导致的抗氧化损伤;同时,柚皮苷还可以通过参与调控Ihh和PTHr P基因的表达,促进软骨细胞的增殖、发育和生长板周边血管的形成,进而恢复由福美双诱导的胫骨生长板的损伤。综上,通过研究发现柚皮苷可以作为治疗TD的潜在药物。4.漆树酸通过调控Wnt4和ColⅡ表达对肉鸡TD的影响漆树酸是一种传统中草药,可用于治疗骨关节炎及多种骨骼疾病。但是,漆树酸是否对TD具有治疗作用目前尚无报道。因此,本研究的目的是探究漆树酸是否对TD具有改善作用。300只1日龄的AA肉鸡被平均分成三组,对照组、TD组和漆树酸治疗组。统计分析各组肉鸡的胫骨指标变化、肝脏抗氧化指标变化、血管生成变化、软骨病理变化及Wnt4与CollⅡ基因和蛋白质表达变化。研究结果表明,TD组肉鸡胫骨各指数低于对照组,而生长板的宽度明显增大(p<0.05)。在漆树酸治疗组中,胫骨的长度,宽度和重量明显得到改善,胫骨生长板的宽度也趋于恢复正常,并且胫骨血管分布也得到了改善。与对照组相比,TD组GSH-Px,T-AOC和SOD水平显著降低(p<0.05),MDA水平和生长板宽度增加,而漆树酸组显著增加了肝脏抗氧化能力。免疫组化分析显示,漆树酸可以显著促进Wnt4和CollⅡ基因表达。此外,与对照组相比,TD组中Wnt4和ColⅡ基因表达下调,而漆树酸处理则上调Wnt4和CollⅡ基因和蛋白表达。与第一章转录组筛选的差异基因Wnt4和ColⅡ表达均下调的结果一致。总之,通过研究发现,漆树酸可以通过调节Wnt4和CollⅡ基因的表达进而改善胫骨的发育状态,缓解TD产生的跛行症状,并可以刺激软骨细胞的生长和再发育,促进骨的再吸收和胶原蛋白的形成。