胶质瘤是人脑最常见的肿瘤,其中恶性胶质瘤由于其位置的特殊性及生长的侵袭性,对人体危害极大。恶性胶质瘤的侵袭性生长和快速演进与瘤组织中活跃的血管生成有密切关系,常被用来研究肿瘤的血管生成。深入研究胶质瘤血管生成特性及其机制对于该肿瘤的抗血管生成治疗,具有重要意义。新近发展起来的高密度组织微阵列(high-density tissue microarrays,又称组织芯片,tissue chips)使得人们能同时在同一载体上观察大量具有某一特性的组织标本。构建不同类型的组织芯片并以此研究基因和蛋白质表达情况,对人类后基因组学的研究与发展,尤其对于认识疾病相关的基因功能和蛋白质变化与分子诊断、评价治疗过程与效果、判断疾病预后以及新药筛选与开发等,都具有重要意义。本研究应用人脑星形细胞肿瘤组织制作含有不同形态微血管的组织芯片,在此基础上,观察所制作的组织芯片在血管生成研究中的应用性。此外,利用计算机辅助的三维重建技术对星形细胞肿瘤微血管进行重建。主要结果和结论如下:1.建立了组织芯片制作方法,并制作出含星形细胞肿瘤微血管(AstMV)的组织芯片(1)选择有代表性且微血管形态特殊的人脑星形细胞肿瘤组织区域,经过供体组织的处理、受体蜡块的制作、打孔、取样、点样、平整组织芯片蜡块表面及切片等步骤,制作出符合血管生成研究的含AstMV的组织芯片。在制作芯片过程中,我们自制了取样及点样定位系统,使这两步操作更加容易、精确,大大提高了制作芯片的质量和效率。(2)获得了一些制作组织芯片的体会。这些体会包括:对用于制作“受体”蜡块的蜡进行特殊处理,并使制成的蜡块既有硬度又有韧性,且厚度以1.0～1.2cm为宜;在做组织芯片前一定要检查受体蜡块表面是否与底面平行。打孔、取样及点样动作要轻柔,以免损坏针头及引起受体蜡块的皲裂。取样及点样都需要控制针的深度,粗针进针的深度小于细针深度约0.2mm为好。在结束之前需在整齐点的外侧加1~2个点,以利于本课题受国家自然科学基金资助(编号:30370552)<WP=9>准确判断各点组织的诊断。受体蜡块还需放入放入37℃烤箱中15分钟,使供体组织的蜡与受体组织的蜡融合在一起,并把部分突出的组织压入孔中。2. 应用自制AstMV组织芯片检测了星形细胞肿瘤血管生成活性应用自制组织芯片进行了CD34 、Ⅷ-R Ag、CD105、VEGF和GFAP免疫标记,结果显示,不同级别的星形细胞肿瘤,其各点血管数不同,而不同的标记物所标记的微血管数也不同。对于星形细胞肿瘤Ⅰ级, CD34 、Ⅷ-R Ag和CD105三种抗体检测的微血管数在统计学上无明显差别;对于星形细胞肿瘤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,CD34 、Ⅷ-R Ag 标记的微血管数明显多于CD105标记的血管数,两者与CD105相比,相差非常显著;对于CD34 和Ⅷ-R Ag抗体标记的微血管数,星形细胞肿瘤Ⅰ级与星形细胞肿瘤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各级相比,相差非常显著。CD34 和Ⅷ-R Ag在各级别星形细胞肿瘤间标记的微血管数相比,无显著差异。结果提示,这三种内皮细胞标记物在星形细胞肿瘤微血管内皮上的表达存在不同程度的差异性,在应用时应根据目的适当选择。对于VEGF抗体,随着恶性程度的增加,星形细胞肿瘤组织表达的VEGF也增多;而对于GFAP,则刚好相反,它随着星形细胞肿瘤恶性程度的增加,表达逐渐减弱。上述结果与既往采用传统病理切片所获得的结果一致,说明星形细胞肿瘤组织芯片能较好地代表其原组织的特征,并具有其明显的应用优势。3.利用连续切片的内皮细胞标记和计算机软件对星形细胞肿瘤微血管进行了三维重建(1)建立了利用常规制样的人脑星形细胞肿瘤组织进行微血管三维重建的基本方法应用组织的连续切片对1例人脑III级星形细胞瘤的部分微血管进行了计算机三维重建。其主要步骤包括确定对位孔、连续切片、Ⅷ-R Ag抗体标记微血管内皮、图像采集与处理以及计算机软件辅助的三维重建微血管。所得到的三维图像真实地模拟了肿瘤微血管的特殊形态,并可任意旋转、翻转观察。我们体会到,肿瘤微血管三维重建制样的技术关键在于切片的连续性与对位、内皮标记和软件的选择与应用。我们运用连续采图再依次拼接起来的方法,克服了两个对位孔不能同时在高倍镜下被观察到而引起对位不准的问题。用Ⅷ-R Ag抗体标记肿瘤微血管内皮细胞用于微血管三维重建,取得了较好的效果,目前尚未见同类报道。(2)初步观察了星形细胞肿瘤微血管三维形态特征结果显示,恶性星形细胞肿瘤微血管与正常脑微血管迥然不同,其分枝和走行怪异,表明星形细胞肿瘤的微血管不仅丰富,而且具有形态结构的多样性和异质性。这<WP=10>一结果对于认识恶性肿瘤血管生成三维结构特性、发生机制及其在抗血管生成治疗可能具有重要意义,但目前尚未见类似报道。综上所述,星形细胞肿瘤微血管三维图像的成功构建,加之上述微血管组织芯片的构建,为进一步构建数字化肿瘤微血管,以及研究星形细胞肿瘤微血管与血管生成因子间的数学模型关系奠定了基础。