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背景与目的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是继发于脓毒症、严重创伤、失血性休克等的创伤相关并发症的关键诱因,也是导致创伤后急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的重要原因。病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)或损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)—模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)—炎症反应是目前研究SIRS发病机制的主线。由于线粒体特殊的结构和起源,线粒体相关的DAMPs(mitochondrial DAMPs,MTDs/mtDAMPs)成为目前研究的热点之一,其中以mtDNA最受关注。基于“线粒体内共生学说”线粒体与细菌具有一定的相似性,而mtDNA含有丰富的、低甲基化的CpG序列,这同样与细菌DNA非常相似。多项研究均证实,在组织损伤后,mtDNA可以被迅速释放到外周血中,与中性粒细胞、巨噬细胞等的TLR9结合,活化下游的MAPK信号通路,促进多种炎症因子的合成和释放。TLR9是细胞内识别核酸的模式识别受体,在生理状态下主要位于细胞内质网膜上,当受到TLR9配体(含有未甲基化的CpG序列的细菌或病毒DNA)刺激时,它可以向吞噬溶酶体膜转移,继而与吞噬小体内的配体结合,活化下游的MAPK信号通路。既往的研究发现,用mtDNA刺激巨噬细胞能够增强TLR9的表达,并且TLR9对mtDNA的识别同样是依赖于未甲基化的CpG序列。我们课题组前期的结果显示,TLR9-p38 MAPK信号通路介导了 mtDNA在巨噬细胞中的致炎潜能。这些结果提示TLR9活化后从内质网膜向溶酶体膜转移,在mtDNA发挥致炎作用的过程中起重要作用。LL-37作为抗菌肽cathelicidins家族在人体中的唯一成员,近年来的研究显示它能够与胞外的DNA结合,促进细胞外的DNA进入胞内。但是这些进入胞内的LL-37-DNA复合物是否具有致炎作用,目前的研究存在争议,有研究发现LL-37与self-DNA(绝大部分为nDNA)结合后,使得原本惰性的self-DNA进入细胞内,活化TLR9,促进下游干扰素的表达;也有研究表明LL-37虽然能够与DNA结合,促使其进入角质细胞内,但是它与DNA结合后会将其中和,使DNA感受器无法识别DNA,继而抑制下游炎症因子的产生。这说明在机体疾病发生、发展以及缓解的不同过程中,LL-37对DNA致炎作用的影响也不同。而关于LL-37对mtDNA致炎作用的影响,目前的研究很少,只有在动脉粥样硬化斑块的形成中发现LL-37可以保护mtDNA,通过逃避DNase II的降解和自噬来促进炎症反应,但是在其他疾病中,LL-37对mtDNA炎症作用的影响目前尚缺乏相应的研究。本研究首先通过体外细胞实验来探索LL-37对细胞外mtDNA进入巨噬细胞及其所诱导炎症反应的影响和分子机制,继而在体内实验中证实了 LL-37小鼠同源蛋白CRAMP在mtDNA暴露诱导的小鼠肺组织炎症反应中的作用。为LL-37 未来成为靶向 mtDNA 治疗急性肺损伤提供了理论依据。材料与方法1.本实验采用体外荧光标记的mtDNA与LL-37共同刺激培养THP-1巨噬细胞,荧光显微镜及流式细胞仪检测LL-37对巨噬细胞摄入mtDNA的影响。利用ELISA实验检测不同浓度的LL-37对THP-1巨噬细胞炎症因子释放的影响,以排除LL-37本身的致炎作用。然后分别利用荧光定量PCR和ELISA实验检测LL-37对mtDNA诱导的THP-1巨噬细胞炎症因子合成和释放的影响。利用Western blot实验检测LL-37对mtDNA诱导的THP-1巨噬细胞p38 MAPK通路激活的影响。随后采用体外荧光标记的mtDNA与LL-37共同处理THP-1巨噬细胞,并于处理后利用细胞免疫荧光技术观察进入细胞内的mtDNA与TLR9和溶酶体的定位,进一步探索LL-37对mtDNA诱导的炎症反应的影响的可能的分子机制。2.采用气管滴入mtDNA的方式构建mtDNA暴露诱导的小鼠肺组织炎症反应模型,通过检测肺组织石蜡切片HE染色以及ELISA检测肺泡灌洗液中促炎因子水平,观察并证实mtDNA暴露可以诱导肺组织炎症;采用气管滴入mtDNA或LPS、以及CLP和高潮气量机械通气模型,Western blot实验检测四种模型中肺组织LL-37小鼠同源蛋白CRAMP的表达水平;通过气管滴入CRAMP,检测肺组织石蜡切片HE染色和ELISA检测肺泡灌洗液中促炎因子释放水平,排除CRAMP本身对小鼠肺组织炎症的作用;随后采用气管滴入CRAMP与mtDNA的混合液,通过检测肺组织石蜡切片HE染色以及ELISA检测肺泡灌洗液中炎症因子水平来验证CRAMP是否对mtDAN诱导的肺组织炎症反应具有抑制作用;最后采用 Western blot 实验检测 mtDNA,CRAMP,或 mtDNA+CRAMP 暴露后肺组织p38 MAPK信号通路活化的差异,来明确CRAMP对mtDNA诱导的p38 MAPK通路磷酸化激活的影响。结果1.LL-37促进THP-1巨噬细胞吞噬并清除细胞外mtDNA,而不活化胞内的TLR9-p38 MAPK信号通路,减轻mtDNA诱导的炎症因子的释放荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果显示,mtDNA单独处理时会少量进入THP-1巨噬细胞内,当与LL-37同时处理时,大量的mtDNA被THP-1巨噬细胞摄取。ELISA检测结果显示,LL-37对巨噬细胞的致炎作用依赖于其浓度,低浓度的LL-37本身对巨噬细胞炎症因子表达的影响微乎其微;细胞外mtDNA可以促进THP-1巨噬细胞释放TNF-α、IL-lβ等促炎因子的合成和释放,而LL-37 与 mtDNA 同时处理时细胞培养上清中炎症因子的释放减少。荧光定量 PCR检测显示LL-37可以抑制细胞外mtDNA诱导的炎症因子(TNF-α、IL-1β)的合成。Western blot结果显示LL-37可以抑制细胞外mtDNA诱导的p38 MAPK蛋白的磷酸化激活。免疫荧光观察显示,单独使用mtDNA刺激细胞时,少量mtDNA进入细胞内,弥散分布在细胞质中TLR9 阳性的区域内,但是当用LL-37与mtDNA共同刺激细胞时,更多mtDNA进入细胞,而这些mtDNA并不位于TLR9强阳性的区域,同时,我们也发现不管LL-37是否存在,进入细胞内的mtDNA都分布在细胞质中溶酶体分布阳性的区域内。2.体内实验证实LL-37小鼠同源蛋白CRAMP可以抑制mtDNA暴露诱导的小鼠肺组织炎症HE染色显示,气管滴注mtDNA可以诱导C57BL/6小鼠肺组织炎症,主要表现为肺组织水肿、血管充血、肺泡壁明显增厚、炎症细胞浸润等炎症损伤表现;气管滴注不同浓度的CRAMP小鼠均未见明显的肺部炎症表现;气管滴注预先孵育过的mtDNA和CRAMP的混合液,可以减轻mtDNA暴露诱导的小鼠肺组织炎症损伤。肺泡灌洗液ELISA检测显示,气管滴注mtDNA可导致小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的释放明显升高;气管滴注不同浓度的CRAMP小鼠BALF中炎症因子的水平均与阴性对照组无明显差异;气管滴注预先孵育过的mtDNA和CRAMP的混合液,可以降低小鼠BALF中炎症因子的释放。Western blot实验显示,在LPS或mtDNA诱导的肺组织炎症模型以及CLP和高潮气量机械通气模型中,CRAMP蛋白的表达均显著升高;气管滴注预先孵育过的mtDNA和CRAMP的混合液可以抑制mtDNA诱导的p38 MAPK蛋白的磷酸化激活。结论和意义1.证实了 LL-37可以与细胞外mtDNA结合,促进其转运至细胞内:既往关于LL-37与细胞外DNA的结合作用的研究多集中在细胞核DNA,对于LL-37对细胞外mtDNA影响的研究较少,这为更全面了解LL-37促进细胞外DNA进入细胞提供了新的证据。2.初步证实LL-37与mtDNA结合后,使得转运至细胞内的mtDNA无法被TLR9识别,抑制mtDNA介导的TLR9-p38MAPK信号通路的活化,减轻炎症反应。这揭示了 LL-37在mtDNA的内源性致炎反应中新的作用,为LL-37抑制mtDNA诱导的巨噬细胞炎症反应的机制研究提供了新的依据。3.在体内实验中证实CRAMP可以抑制mtDNA暴露诱导的小鼠肺组织炎症反应和损伤。这为未来临床采用LL-37作为靶向mtDNA治疗肺组织炎症和损伤提供了理论依据。