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第一部分缺血性脑卒中恢复期睡眠限制对脑实质CD169+细胞浸润及对神经再生和功能恢复的影响
目的：探讨缺血性脑卒中恢复期睡眠限制对缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞浸润的影响，以及进而对神经再生和功能恢复的影响
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，使用线栓法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，再灌注28天。MCAO后14天开始连续14天的睡眠限制，每天20小时。MCAO后27天，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，注射3次，间隔8小时，最后一次注射后16小时对小鼠经心脏灌注取材后免疫荧光染色缺血侧脑室下区(subventricular zone，SVZ)和纹状体区BrdU+/DCX+细胞数。MCAO后28天，免疫荧光染色缺血侧侧脑室和第三脑室脉络丛(choroid plexus，CP)以及缺血侧脑实质CD169+细胞数。MCAO后28天，行为学检测，包括爬杆实验(Pole test)、提高的躯体摆动实验(EBST)和转轴测试(Rotarod test)。
结果：与没有睡眠限制小鼠相比，缺血性脑卒中恢复期睡眠限制显著降低缺血性脑卒中后28天SVZ和纹状体BrdU＋/DCX+细胞数。侧脑室与第三脑室CP区免疫荧光和脑脊液流式细胞术结果显示：与没有睡眠限制小鼠相比，睡眠限制显著降低缺血性脑卒中后28天CD169+巨噬细胞数，同时也显著降低缺血侧脑实质中CD169+巨噬细胞数。睡眠限制显著增加缺血性脑卒中后28天EBST小鼠向左摆动的时间和缩短小鼠在Rotarodtest转轴上的停留时间，还显著延长Poletest中的转身时间和落地时间。
结论：睡眠限制可显著减少缺血性脑卒中恢复期侧脑室和第三脑室脉络丛以及缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞数量，抑制缺血性脑卒中恢复期神经再生和神经元分化。
第二部分缺血性脑卒中恢复期CD169+巨噬细胞迁移入脑的路径和机制
目的：探讨缺血性脑卒中恢复期CD169+巨噬细胞迁移入脑的路径及机制
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型(缺血60分钟)，再灌注28天。MCAO后14天开始进行连续14天的睡眠限制，每天20小时。MCAO后14天左侧脑室置管，并在睡眠限制后1和7天分别给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)。MCAO后28天，westernblotting检测各组缺血侧侧脑室和第三脑室脉络丛(CP )的IFN-γ、IFN-γR、CX3CL1和ICAM-1表达；免疫荧光染色缺血侧CP区IFN-γR表达，以及缺血侧CP和缺血侧脑实质CD169+细胞数。MCAO后28天，流式细胞术检测脑脊液CD169+细胞数。MCAO后27天，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，注射3次，间隔8小时，最后一次注射后16小时对小鼠经心脏灌注取材后免疫荧光染色缺血侧脑室下区(SVZ)和纹状体BrdU+/DCX+细胞数。MCAO后28天，行为学检测，包括爬杆实验(Pole test)、提高的躯体摆动实验(EBST)和转轴测试(Rotarod test)。
结果：与无睡眠限制小鼠相比，睡眠限制可显著减少脑卒中恢复期CP区IFN-γ、IFN-γR、CX3CL1和ICAM-1表达。进一步免疫荧光结果显示，与睡眠限制小鼠相比，睡眠限制小鼠缺血性脑卒中恢复期侧脑室给予IFN-γ、CX3CL1或ICAM-1中和抗体，CIS后28天缺血侧CP以及脑脊液中CD169＋巨噬细胞数显著下降，且SVZ和纹状体BrdU+/DCX细胞数显著降低，给予抗体干预还可显著延长小鼠Poletest的转身时间与落地时间，缩短小鼠在Rotarodtest转轴上停留的时间。
结论：脑卒中恢复期睡眠限制通过IFN-γ/IFN-γR信号通路减少CP表达趋化因子CX3CL-1和ICAM-1，进而减少CD169+巨噬细胞从外周通过CP和脑脊液向缺血侧脑实质中浸润。
第三部分缺血性脑卒中恢复期睡眠限制通过减少缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞浸润对Tregs的影响
目的：研究缺血性脑卒中恢复期睡眠限制通过减少CD169+巨噬细胞向缺血侧脑实质迁移而对调节性T细胞(Tregs)百分比的影响，进而对神经再生与功能恢复的影响。
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，线栓法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型(缺血60分钟)，MCAO后28天。MCAO后14天开始进行连续14天的睡眠限制，每天20小时。提取光荧光转换蛋白Kaede转基因小鼠脾脏CD169+巨噬细胞。C57BL/6小鼠MCAO后第14天开始侧脑室置管，在14和21天侧脑室给予C57BL/6小鼠Kaedegreen+CD169+巨噬细胞，并在第22天通过流式细胞术检测缺血侧脑实质内Kaedegreen+CD169+巨噬细胞数。睡眠限制后1和7天给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)或IgG1同型对照抗体。MCAO后28天，通过流式细胞术检测缺血侧脑实质CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数。
结果：流式细胞术结果显示：MCAO后第22天可在C57BL/6小鼠缺血侧脑实质检测到Kaedegreen+CD169+巨噬细胞，表明CD169＋巨噬细胞可通过脑脊液进入缺血侧脑实质。流式细胞术结果还显示：与非睡眠限制组相比，睡眠限制可显著减少缺血性脑卒中后28天缺血侧脑实质Tregs百分比，而给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)可显著降低缺血侧脑实质Tregs百分比。外源性侧脑室给予Kaede转基因小鼠脾脏提取纯化的CD169+巨噬细胞可显著增加缺血侧脑实质Tregs百分比。
结论：缺血性脑卒中恢复期浸润至缺血侧脑实质的CD169+巨噬细胞可募集Tregs至缺血侧脑实质，而睡眠限制则抑制Tregs募集进而抑制神经再生与功能恢复。
目的：探讨缺血性脑卒中恢复期睡眠限制对缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞浸润的影响，以及进而对神经再生和功能恢复的影响
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，使用线栓法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，再灌注28天。MCAO后14天开始连续14天的睡眠限制，每天20小时。MCAO后27天，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，注射3次，间隔8小时，最后一次注射后16小时对小鼠经心脏灌注取材后免疫荧光染色缺血侧脑室下区(subventricular zone，SVZ)和纹状体区BrdU+/DCX+细胞数。MCAO后28天，免疫荧光染色缺血侧侧脑室和第三脑室脉络丛(choroid plexus，CP)以及缺血侧脑实质CD169+细胞数。MCAO后28天，行为学检测，包括爬杆实验(Pole test)、提高的躯体摆动实验(EBST)和转轴测试(Rotarod test)。
结果：与没有睡眠限制小鼠相比，缺血性脑卒中恢复期睡眠限制显著降低缺血性脑卒中后28天SVZ和纹状体BrdU＋/DCX+细胞数。侧脑室与第三脑室CP区免疫荧光和脑脊液流式细胞术结果显示：与没有睡眠限制小鼠相比，睡眠限制显著降低缺血性脑卒中后28天CD169+巨噬细胞数，同时也显著降低缺血侧脑实质中CD169+巨噬细胞数。睡眠限制显著增加缺血性脑卒中后28天EBST小鼠向左摆动的时间和缩短小鼠在Rotarodtest转轴上的停留时间，还显著延长Poletest中的转身时间和落地时间。
结论：睡眠限制可显著减少缺血性脑卒中恢复期侧脑室和第三脑室脉络丛以及缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞数量，抑制缺血性脑卒中恢复期神经再生和神经元分化。
第二部分缺血性脑卒中恢复期CD169+巨噬细胞迁移入脑的路径和机制
目的：探讨缺血性脑卒中恢复期CD169+巨噬细胞迁移入脑的路径及机制
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型(缺血60分钟)，再灌注28天。MCAO后14天开始进行连续14天的睡眠限制，每天20小时。MCAO后14天左侧脑室置管，并在睡眠限制后1和7天分别给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)。MCAO后28天，westernblotting检测各组缺血侧侧脑室和第三脑室脉络丛(CP )的IFN-γ、IFN-γR、CX3CL1和ICAM-1表达；免疫荧光染色缺血侧CP区IFN-γR表达，以及缺血侧CP和缺血侧脑实质CD169+细胞数。MCAO后28天，流式细胞术检测脑脊液CD169+细胞数。MCAO后27天，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，注射3次，间隔8小时，最后一次注射后16小时对小鼠经心脏灌注取材后免疫荧光染色缺血侧脑室下区(SVZ)和纹状体BrdU+/DCX+细胞数。MCAO后28天，行为学检测，包括爬杆实验(Pole test)、提高的躯体摆动实验(EBST)和转轴测试(Rotarod test)。
结果：与无睡眠限制小鼠相比，睡眠限制可显著减少脑卒中恢复期CP区IFN-γ、IFN-γR、CX3CL1和ICAM-1表达。进一步免疫荧光结果显示，与睡眠限制小鼠相比，睡眠限制小鼠缺血性脑卒中恢复期侧脑室给予IFN-γ、CX3CL1或ICAM-1中和抗体，CIS后28天缺血侧CP以及脑脊液中CD169＋巨噬细胞数显著下降，且SVZ和纹状体BrdU+/DCX细胞数显著降低，给予抗体干预还可显著延长小鼠Poletest的转身时间与落地时间，缩短小鼠在Rotarodtest转轴上停留的时间。
结论：脑卒中恢复期睡眠限制通过IFN-γ/IFN-γR信号通路减少CP表达趋化因子CX3CL-1和ICAM-1，进而减少CD169+巨噬细胞从外周通过CP和脑脊液向缺血侧脑实质中浸润。
第三部分缺血性脑卒中恢复期睡眠限制通过减少缺血侧脑实质CD169+巨噬细胞浸润对Tregs的影响
目的：研究缺血性脑卒中恢复期睡眠限制通过减少CD169+巨噬细胞向缺血侧脑实质迁移而对调节性T细胞(Tregs)百分比的影响，进而对神经再生与功能恢复的影响。
方法：C57BL/6成年雄性小鼠，线栓法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型(缺血60分钟)，MCAO后28天。MCAO后14天开始进行连续14天的睡眠限制，每天20小时。提取光荧光转换蛋白Kaede转基因小鼠脾脏CD169+巨噬细胞。C57BL/6小鼠MCAO后第14天开始侧脑室置管，在14和21天侧脑室给予C57BL/6小鼠Kaedegreen+CD169+巨噬细胞，并在第22天通过流式细胞术检测缺血侧脑实质内Kaedegreen+CD169+巨噬细胞数。睡眠限制后1和7天给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)或IgG1同型对照抗体。MCAO后28天，通过流式细胞术检测缺血侧脑实质CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数。
结果：流式细胞术结果显示：MCAO后第22天可在C57BL/6小鼠缺血侧脑实质检测到Kaedegreen+CD169+巨噬细胞，表明CD169＋巨噬细胞可通过脑脊液进入缺血侧脑实质。流式细胞术结果还显示：与非睡眠限制组相比，睡眠限制可显著减少缺血性脑卒中后28天缺血侧脑实质Tregs百分比，而给予中和抗体(anti-IFN-γ、anti-CX3CL1或anti-ICAM-1)可显著降低缺血侧脑实质Tregs百分比。外源性侧脑室给予Kaede转基因小鼠脾脏提取纯化的CD169+巨噬细胞可显著增加缺血侧脑实质Tregs百分比。
结论：缺血性脑卒中恢复期浸润至缺血侧脑实质的CD169+巨噬细胞可募集Tregs至缺血侧脑实质，而睡眠限制则抑制Tregs募集进而抑制神经再生与功能恢复。