固有无序蛋白(Intrinsically Disorder Proteins,IDPs),也称为IUPs(Intrinsically Unstructured Proteins)其生理条件下缺乏稳定的三级结构,根据所含无序结构的多少可分为完全无序和部分无序两类。固有无序蛋白参与生物体内重要的生理病理过程,由于IDPs结构的可塑性和能与配体进行一对多的结合使其常作为蛋白互作网络中的节点蛋白,并与多种底物结合发挥不同功能。IDPs在植物中常参与细胞信号转导、转录调控、磷酸化调节过程以及发挥分子伴侣和分子屏蔽等功能。目前通过对LEA、GRAS等蛋白家族的研究发现IDPs与植物对外界环境应答和保持抗逆性有关,因此获得与抗逆相关的IDPs对于理解植物抗逆性与IDPs的关系有重要意义。但是,目前对此类蛋白的研究多为鉴定单个的IDPs在植物中生理功能,目前还未见全面筛选与植物抗逆相关IDPs的报道。本实验室前期研究发现,萌发初期未突破种皮大豆种子(R0期)经脱水胁迫后的存活率为83%,具有脱水耐受性,而突破种皮15mm(R15期)后的大豆种子存活率几乎为零,为脱水敏感性材料。因此本文以R0期和R15期大豆胚根作为实验材料,开展比较蛋白质组学的研究。由于IDPs多具有热稳定性,热处理可富集IDPs,因此本文提取R0和R15时期大豆胚根的可溶性蛋白,经100℃热处理10min后,离心获得上清,即为热稳定蛋白。利用i TRAQ联合HPLC-ESI-MS/MS检测这两个时期的差异蛋白。结果显示,质谱共检测到4132个蛋白,统计学检验后,共得到795个差异蛋白。以差异倍数在2倍以上为界,进行统计学分析,结果表明,R0期高表达蛋白有170个,R15期高表达的蛋白有89个,含量不变的蛋白有536个。利用Espritz在线软件对差异蛋白和大豆总蛋白(蛋白序列来自大豆数据库Gm GDBGlyma109)进行无序分析。结果显示,在测定的795个差异蛋白中,100%无序和60%~90%无序蛋白的比例分别为3.01%和11.82%,均高于大豆总蛋白中的0.96%和7.87%。这表明热处理较好的富集了无序程度>60%的蛋白。其中在R0期高表达蛋白中,无序程度大于60%的蛋白比例为60.6%,而不变的和R15期高表达蛋白中仅为22.4%和12.4%,表明脱水胁迫耐受性强的大豆胚根中无序蛋白的比例明显高于脱水敏感材料,暗示着IDPs与植物的脱水胁迫耐受性呈正相关。分别利用egg NOG数据库、GO数据库和KEGG数据库对差异蛋白进行功能注释。其中egg NOG数据可对直系同源类群功能注释,结果显示,大多数蛋白参与转录,核糖体结构与生物合成、翻译后修饰,蛋白转运,伴侣、碳水化合物转运与代谢和氨基酸转运与代谢等功能。GO数据库注释结果显示,在R0期高表达蛋白中有更多的蛋白参与营养积累、转录延伸、水分应答和胚胎发育。说明在胁迫耐受性组织中有更多的蛋白参与对水分的应答和营养积累。KEGG注释结果显示,在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径和苯丙氨酸代谢途中有显著富集,这两个途径与抗氧化胁迫途径有关,说明在种子萌发过程中的热稳定蛋白可能参与抗氧化过程。根据蛋白组学和结构预测结果,在R0期高表达蛋白和不变的蛋白中共挑选了10个蛋白进行结构和功能分析。利用圆二色谱法测定了10个蛋白的二级结构,其中有4个蛋白具有典型的无规则卷曲结构,分别是1号蛋白transcription activator-related、5号蛋白(Cwf18)、9号蛋白(Arpp19)和10号蛋白PM35。其余的6个蛋白则以α-螺旋和β-折叠结构为主。比较这10个蛋白在反复冻融胁迫条件下对LDH酶的保护作用,结果显示,具有典型α-螺旋结构的7号HSBP蛋白与LDH酶在1:1、5:1和10:1混合,冻融3次后,LDH残留酶活分别是82.5±10.3%、92.7±10.9%和96.7±12.6%,在这10个蛋白中保护能力最强。与溶菌酶相比,具有无规则卷曲结构的1号蛋白transcription activator-related、5号蛋白Cwf18、9号蛋白Arpp19和10号蛋白PM35以及其他5个以α-螺旋和β-折叠结构为主的2号蛋白LOC100812629、3号蛋白COX6b-1、5号蛋白HMG蛋白、6号蛋白COX VIb和8号蛋白Remorin-like均对冻融条件下的LDH酶有保护作用。但是具有无规则卷曲结构为主的蛋白对LDH的保护能力并非均强于有结构的蛋白,因此结合圆二色谱测定的二级结构和对酶的保护效果来看,蛋白对LDH酶活保护能力与无序程度并不呈正相关。结合前人报道,我们推测无结构的蛋白可通过分子屏蔽的方式,抑制靶分子碰撞聚集、或通过无序伴侣的方式与配体的疏水氨基酸相互作用而阻止配体蛋白间的聚集;而有结构蛋白则可能通过分子伴侣、或减少冰晶形成等不同的机理对酶发挥保护功能。