研究背景及目的人类胃肠道寄居着大量的微生物,重量可达1-2kg,数量多达1014,为人体细胞的10倍,种类高达1000余种,构成人体肠道内复杂而庞大的微生态系统。尽管肠道菌群种类繁多,但主要以四大菌门为主：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。种类不同的肠道菌群相互拮抗、相互协同,在质和量上形成一种动态平衡,组成人体肠粘膜屏障中的生物屏障部分,在人体中主要发挥着重要作用：拮抗致病菌,维护黏膜屏障；免疫调节(包括全身和局部免疫)；降解食物残渣,合成营养成分等。一旦肠道微生物群的组成、分布和数量发生改变超出自身调节能力,即出现肠道微生态失衡,可引起肠道乃至全身的一系列病理病生改变,导致诸多疾病的发生,如抗生素相关性肠炎、炎症性肠病(IBD)、肠激惹综合征(IBS)、肠癌甚至肥胖、糖尿病、冠心病等。抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea,AAD)是指应用抗生素后导致肠道菌群失调而引起的最常见的医源性腹泻,是很多种抗生素常见的不良反应之一。轻度的AAD主要表现在大便频次及性状上的改变,重度的AAD主要表现为致病菌大量繁殖,引起肠黏膜损伤和炎症,发生炎症性腹泻。其中艰难梭菌感染性腹泻(CDAD)占了AAD的10%-25%。其他致病菌还有沙门菌、产气荚膜梭菌、产酸克雷伯菌、念珠菌、金葡菌等。抗生素相关性腹泻的危险因素很多,宿主因素方面,包括年龄>65岁、女性、免疫力降低、合并严重基础疾病等；抗生素因素方面,几乎所有的抗生素都会引起抗生素相关性腹泻,但对于肠道微生态的影响及腹泻出现的概率主要与其抗生素的抗菌谱、药代动力学、用药途径和到达肠腔中的浓度有关。广谱抗生素特别是针对肠杆菌及厌氧菌和那些在肠腔残留浓度较高的抗生素(抗生素较少吸收或不完全吸收或经胆汁分泌)较易引起肠道细菌的改变,广谱青霉素类、头孢菌素类及克林霉素等引起的腹泻发生率较高。现有研究认为AAD的发病机理有：抗生素抑制了正常优势菌群的生长,临床可以表现为无症状,或者停用药物后正常菌群会在短期恢复,对于部分患者正常菌群出现失衡后会导致机会致病菌(如艰难梭菌等)的过度生长,从而出现腹泻甚至伪膜性肠炎。此外,抗生素造成的菌群失调还破坏了微生态的代谢功能,导致碳水化合物吸收减少从而出现渗透性腹泻,或减少短链脂肪酸的产生,从而减少结肠对于液体的吸收,最终出现分泌性腹泻。另一方面,抗生素本身所致的变态反应、毒性作用可直接引起肠粘膜损害和肠上皮纤毛萎缩,从而导致吸收障碍性腹泻。最后,某些抗生素(如大环内酯类)是胃动素受体的激动剂,而胃动素为胃肠肽,可以刺激胃窦和十二指肠收缩,引起肠蠕动改变,导致腹泻、肠痉挛和呕吐。目前微生态制剂,包括益生菌、益生元和合生元已作为一种新型手段广泛应用于抗生素相关性腹泻的治疗,其根本目的在于恢复和稳定原来的微生态系统,但其具体的有效性及机理机制研究仍较为匮乏,制备抗生素诱导的腹泻模型有利于检验微生态制剂对抗生素相关性腹泻的治疗作用及机理机制研究,此外还有利于微生态制剂的推广使用。抗生素诱导的肠道菌群失调腹泻模型的建立方法有很多,大致可以分为2大类：1.单用抗生素类型使用抗生素各异,包括有头孢曲松钠、盐酸林可霉素或克林霉素、氨苄青霉素、多粘菌素等,甚至两联或三联用药；剂量也各异,采取临床1-20倍剂量不等进行灌胃,给药天数在1-10天不等,如李景等以氨苄青霉素灌胃小鼠,每次灌胃0.5ml(0.45g/ml),2次/d,连续5d造成肠道菌群失调腹泻模型。2.抗生素+致病菌类型主要是在使用抗生素造成菌群失调的情况下,人为地给予临床腹泻病人常见致病菌,造成菌群失调性腹泻模型,如熊德鑫等在用氨苄青霉素钠(15～40g/kg)8小时后喂服攻击菌(107～109CFU/ml,0.2ml/次)痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌造成腹泻模型。方法虽然很多,但是仍存在许多不足：相关文献仍没有统一的判断抗生素相关性腹泻的动物模型标准,大多文献只是根据菌群失调概念进行判定,对于腹泻症状是否出现有的文献并没有提及,有的文献只是略提腹泻率,但没有具体评价标准；此外,造模用的抗生素及其剂量、时间等仍未有统一明确的标准。本研究中,我们试图根据临床腹泻及菌群失调定义制定抗生素相关性腹泻的标准,用不同剂量的克林霉素或三联抗生素制作出稳定的、重复性较好的抗生素相关性腹泻模型,此外,还通过细菌培养和荧光定量PCR方法动态监测整个造模过程大鼠常见菌群的变化,确定造模用药时间、剂量和模型的自然病程。方法1.抗生素相关性腹泻模型给药方法及时间：分别用生理盐水(A)、25mg/ml克林霉素(B)、50mg/ml克林霉素(C)、75mg/ml克林霉素(D)、(25+28+14mg/ml)克林霉素+氨苄西林+链霉素(E)、(50+56+28mg/ml)克林霉素+氨苄西林+链霉素(F)、(75+84+42mg/ml)克林霉素+氨苄西林+链霉素(G)溶液各2ml给予对照组(A)和克林霉素低(B)、中(C)、高(D)剂量组及三联抗生素低(E)、中(F)、高(G)剂量组的SD大鼠,共灌胃7天,之后进行为期8天的病程观察。2.每天对大鼠体重、饮食、饮水、粪便形态等进行记录,从第7天至第14天对固定时间收集的大鼠2小时粪便总重进行称重,并将粪便烤干后计算粪便的干湿重比,用以作为评价大鼠腹泻症状的指标。3.分别于实验的第1、4、8、11、14天无菌采集各组大鼠粪便,用细菌培养和荧光定量PCR方法对其进行常见菌群的检测,并对这两种方法检测出来的结果进行对比分析。4.在第11天和第15天各组分别各处死一半的大鼠,采取回肠、盲肠和结肠组织进行病理学检测,并收集盲肠粪便进行盲肠细菌定植情况分析。结果1、体重、饮食、饮水结果显示：与对照组相比,各造模组体重变化、饮食量无明显差异；各克林霉素组饮水量呈升高趋势,但无剂量相关性,而三联抗生素组饮水量呈升高趋势,且与剂量呈正比。2、腹泻症状评定粪便形态结果显示：与对照组相比,各造模组(除D组外)给药第2天开始出现不同程度的软便、稀便,症状在第6、7天最明显,持续至第14天,第15天各组症状开始有所恢复。不同组间比较发现,B、E、F、G组的症状更为明显而稳定。粪便干湿重比值显示：与对照组相比,各造模组(除D组外)在第7至第14天粪便的干湿重比值明显下降,且较平稳,具有明显统计学差异；此外,克林霉素组剂量与粪便干湿重比值下降程度具有一定负相关性,三联抗生素组无剂量相关性。2小时粪便总重显示：雌、雄大鼠粪便总重差异较大；与对照组相比,B、C、F组雌、雄2小时粪便总重均明显增加,具有统计学差异,D组雌、雄和G组雄性2小时粪便均无明显统计学差异,E组不同天数波动范围较大,有的无明显统计学差异。3.不同天数菌群变化细菌培养结果显示：对照组在不同天数菌群基本比较稳定。而各造模组从给药后出现乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌明显下降,大肠杆菌、酵母菌明显增加,肠球菌、金葡菌和厌氧球菌先被抑制,后在第8天明显增加,以上在第14天未能恢复正常；而拟杆菌先被抑制,在第14天得到不同程度的恢复。此外,克林霉素组和三联抗生素组菌群变化较相似,不同剂量之间也未见明显统计学差异。荧光定量PCR结果显示对照组在不同天数菌群也比较稳定。C组总的细菌无明显变化,双歧杆菌、乳酸杆菌明显下降,大肠杆菌明显增加,肠球菌、拟杆菌先减少,后在第8天恢复甚至明显增加,持续至第11天。F组总的细菌在用药第四天出现明显下降,相应的拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌均明显下降,在第8天至11天,双歧杆菌,乳酸杆菌仍处于较低水平,而拟杆菌、大肠杆菌、肠球菌明显增加。4.荧光定量PCR和细菌培养结果对比显示：用qPCR检测出拟杆菌数量高于细菌培养方法,而检测出大肠杆菌数量低于细菌培养方法,乳酸杆菌、双歧杆菌和肠球菌两种方法检出率比较一致。5.盲肠细菌定植结果显示：第11天,与对照组相比,C组和F组盲肠定植细菌中总的细菌和拟杆菌无明显统计学差异,大肠杆菌和肠球菌明显增加,成为优势菌群,乳酸杆菌和双歧杆菌明显下降。第15天,与对照组相比,C组和F组总的细菌无明显差异,双歧杆菌、乳酸杆菌得到一定恢复,但是优势菌群仍为拟杆菌、大肠杆菌和肠球菌。6.不同部位组织病理学结果显示：在第11天和第15天,与对照组相比,大鼠回肠、结肠HE染色镜下观察无明显炎症表现,而在盲肠部位,各造模组均出现轻中度炎症表现,其中B、D、F组炎症程度相对其他造模组更严重。结论1.不同剂量组的克林霉素和三联抗生素均能诱导菌群失调,但结合腹泻指标,认为B、F组作为抗生素相关性腹泻模型更优。2.抗生素的剂量与诱导的腹泻症状及菌群失调及炎症严重程度无明显剂量相关性。3.该模型属于轻中度腹泻模型,病变部位主要在于盲肠,病程能超过一周。4.荧光定量PCR与细菌培养方法可以相辅相成,更有利于对菌群失调的检测